Метод автоматизированной проточной цитометрии с двойным окрашиванием для мониторинга бактерий в непрерывных биореакторах в реальном времени

Наблюдение за работой микробов в реальном времени

Современная биотехнология опирается на огромные культуры бактерий для производства всего — от лекарств до средств защиты растений. Тем не менее внутри этих вспененных танков невероятно сложно понять, чем именно занимаются микробы в данный момент. В этом исследовании представлен автоматизированный прибор, похожий на микроскоп, который может наблюдать отдельные бактериальные клетки каждый час, показывая не только их количество, но и то, активно ли они растут и копируют свою ДНК. Такое оперативное наблюдение может сделать промышленные ферментации более эффективными, надежными и управляемыми.

Почему подсчета клеток недостаточно

В промышленных ферментерах плотность клеток помогает решать, когда подать дополнительные питательные вещества, когда собирать продукт и насколько продуктивен процесс. Традиционные инструменты — такие как измерение оптической плотности, определение сухой массы или электрические датчики — оценивают общую мутность или массу культуры. Они полезны, но грубы: не позволяют отличить живые клетки от неактивных, не учитывают различия в размере и форме и не дают информации о том, готовятся ли клетки к делению. В результате операторы часто работают в некоторой степени вслепую, корректируя процесс на основе запоздалых или косвенных сигналов.

Новое автоматизированное окно в жизнь бактерий

Автор(ы) опирались на технологию проточной цитометрии, которая быстро измеряет свойства тысяч отдельных клеток, проходящих через лазерный луч. Они подключили полностью автоматизированное устройство для взятия проб и окрашивания к небольшим непрерывным биореакторам. Каждый час устройство брало крошечный объём культуры, химически фиксировало и пермеабилизировало клетки, добавляло два флуоресцентных красителя, разводило образец и отправляло его прямо в цитометр. Один краситель (DAPI) светится пропорционально количеству ДНК в каждой клетке и служит чувствительным индикатором роста и числа копий хромосом. Второй краситель, присоединяемый через «click»-реакцию к строительному блоку ДНК под названием EdU, специфически маркирует клетки, находящиеся в процессе копирования ДНК — те, что стоят на пороге деления.

Отслеживание роста бактерий по одной клетке

Команда протестировала эту систему на трёх непатогенных грамотрицательных бактериях: почвенном штамме Bradyrhizobium, модельном виде Escherichia coli и ассоциированной с растениями Stenotrophomonas rhizophila. В непрерывных культурах они изменяли скорость притока свежей среды в реакторы (скорость разведения) и позволяли автоматической системе работать. Цитометр сообщал и числа клеток, и средний сигнал DAPI на клетку, отражающий содержание ДНК. Во всех условиях рост сигнала DAPI надёжно появлялся раньше видимого увеличения числа клеток или изменений в потреблении кислорода. Это раннее предупреждение показывало, что клетки наращивают репликацию ДНК и рост задолго до того, как традиционные индикаторы зафиксируют сдвиг, что в принципе позволяет раньше корректировать подачу питательных веществ или режим работы. Метод также показал, как каждый вид входил в и поддерживал устойчивый рост при разных скоростях разведения и как при очень высоком разведении культуры разрежались, но обогащались более быстрорастущими клетками с большим содержанием ДНК.

Что сработало — и что нет

В пакетных экспериментах (закрытые колбы или планшеты) краситель на базе EdU успешно выделял всплески репликации ДНК: максимум вскоре после инокуляции с последующим снижением по мере замедления роста. Он отслеживал появление и исчезновение подгрупп клеток с множеством копий хромосом, подтверждая, что метка надёжно отмечает активно реплицирующиеся клетки. Однако при непрерывной подаче EdU в среду малых реакторов он часто замедлял или нарушал рост. Для S. rhizophila культура почти остановилась; для Bradyrhizobium наблюдалось резкое снижение числа клеток; и даже E. coli росла медленнее и показывала сигналы репликации лишь в первые часы. Увеличение концентрации флуоресцентного красителя не решало проблему. Авторы делают вывод, что при непрерывном воздействии EdU слишком ингибирует рост и технически капризен, чтобы служить регулярным маркером репликации в промышленном мониторинге.

Последствия для более «умных» биореакторов

Несмотря на ограничения EdU, рабочий процесс с двойным окрашиванием продемонстрировал, что автоматизированная онлайн-проточная цитометрия может предоставлять богатые, временно разрешённые картины физиологии бактерий. Подсчёт клеток и отслеживание их сигнала DAPI дали надёжную, прямую меру биомассы и ранний индикатор изменений роста при разных скоростях разведения. Интегрированная цепочка образецодержатель–окрашиватель–цитометр работала ежечасно с минимальным участием человека, показав, что такие системы можно внедрить в будущие производственные линии. Хотя конкретный тестируемый маркер репликации пока не готов для повседневного управления бактериальными «фабриками», та же автоматизированная платформа может быть сочетана с другими флуоресцентными метками. В долгосрочной перспективе такого рода мониторинг отдельных клеток в реальном времени может помочь удерживать биореакторы в оптимальной «зоне», повышая выходы, стабильность и качество продукции для широкого спектра микробных процессов.

Цитирование: López-Gálvez, J., Schönfelder, E., Mayer, H. et al. A double-staining automated flow cytometry method for real-time monitoring of bacteria in continuous bioreactors. npj Syst Biol Appl 12, 47 (2026). https://doi.org/10.1038/s41540-026-00694-3

Ключевые слова: автоматизированная проточная цитометрия, бактериальные биореакторы, мониторинг биопроцессов в реальном времени, клеточный цикл и репликация ДНК, индустриальная биотехнология