用于体外和体内活细胞成像的等渗、微创光学增透明介质

在活组织中看得更深

现代生物学在很大程度上依赖荧光显微镜来观察活细胞和器官的动态。然而，许多最有趣的事件发生在混浊、不透明的组织深处，光在其中迅速被散射并模糊。本文介绍了一种温和地使哺乳动物活体组织在光学上更清晰的新方法，称为 SeeDB-Live，使科学家能够在不毒害或扰动所研究细胞的情况下，更深入地观察大脑、类器官和细胞团簇。

为什么活组织难以透视

活组织并非天然透明，因为它由许多微小成分构成——细胞膜、细胞器、纤维——这些成分的光学性质略有不同。光穿过时在每一界面处发生折射和散射，因此在小鼠大脑中，常规显微镜只能看到几百微米的深度。现有的“组织增透”配方通过溶解脂质或将组织浸入粘稠、高折射率溶液来解决固定、死亡样本的问题。但这些混合物对活细胞来说过于苛刻：它们会从组织中抽出水分、扰乱盐平衡，或渗入细胞干扰正常活动，使其不适合用于研究自然的脑信号或器官功能。

围绕血液蛋白构建的温和配方

作者推断，如果能使细胞外液的光学密度与细胞内的水样胞质匹配，光的散射就会减少，组织即使在活着的情况下也会显得更透明。他们筛选了多种化学物质，包括熟悉的甘油以及多种医用造影剂和聚合物。可穿透膜的分子虽然能清除细胞，但会抹去正常的钙反应——这是细胞健康的基本指标。长链聚合物会将盐浓度提高到有害水平。关键的洞见是，体积紧凑、球状的高分子，尤其是血液蛋白牛血清白蛋白（BSA），可以在几乎不改变渗透压的情况下提高介质的折射率。通过仔细调整 BSA 浓度和诸如钙、镁等离子含量，他们得到了 SeeDB-Live，这种溶液的光学折射率与细胞内部接近，同时保持盐和水的平衡基本生理化。

使类器官、球体和切片透明

在得到 SeeDB-Live 后，团队在越来越复杂的活体结构上进行了测试。作为球体生长的肿瘤来源 HeLa 细胞簇以及迷你肠和脑类器官在不发生胀大或收缩的情况下迅速变得更透明。在标准培养基下，荧光信号在大约 100 微米深度后开始衰减；在 SeeDB-Live 中，信号在超过两倍深度仍保持明亮。重要的是，这些结构继续生长并对高钾等刺激作出反应，表明基本生理功能保持完整。用 SeeDB-Live 浸泡的小鼠急性脑切片也在大约半小时内变得透明。随后，双光子和共聚焦显微镜能够在皮层和海马中比以前更深处分辨到神经元、树突和细微结构，“阴影成像”可在切片厚度范围内对所有细胞进行成像，而不仅限于损伤的表面。

在提高可视性的同时保持脑功能

由于即便是细微的盐平衡变化也能改变神经活动，作者在小鼠脑切片中进行了详细测试。对特定皮质神经元的膜片钳记录显示，在 SeeDB-Live 条件下静息电位、发放阈值和尖峰模式与标准人工脑脊液非常相似，仅有适度的参数偏移。嗅球切片中的钙成像表明，自发和诱发的活动模式在频率和振幅上被保留，同时较深层的信号变得更亮。相比之下，其他候选增透剂如甘油和碘克沙醇要么抑制自发发放，要么在数日内减缓生长，凸显了基于 BSA 溶液的相对温和性。

在活体小鼠大脑中观察

研究者随后转向活体小鼠。在在颅骨上开一个小窗并轻柔打开保护性膜后，他们让 SeeDB-Live 冲洗大脑表面。标记的白蛋白渗透到皮层约半毫米处，双光子成像显示来自深层细胞体的荧光信号亮度提高了多达三倍。数百微米以下的精细结构，如树突棘，也变得清晰可见。处理前后对运动、进食和运动协调的测试未发现可检测到的行为副作用，显微镜下观察的脑组织也未见炎症或细胞死亡的激增，即使在数月重复处理后亦然。

扩展光学可测量的范围

在更好的透明度下，团队能够推进到比钙成像更高要求的读出。在脑切片和活体动物中，他们使用快速的相机式外照式荧光成像记录了基因标记神经元的电压变化，包括沿树突传播的动作电位和嗅球中相关细胞的同步发放。这些测量以前受限于散射和低信噪比，现在在更高速度和更大视野下变得可行。由于 SeeDB-Live 为短暂效果，随着白蛋白被冲洗干净，大脑会逐渐恢复到原始状态，但通过带有塑料覆盖的颅窗可以重复该过程以进行长期研究。

这对未来大脑与器官研究的意义

本质上，SeeDB-Live 提供了一种在不明显干扰细胞功能的情况下短暂“去雾”活体哺乳动物组织的方法。通过将细胞间液的光学特性与细胞内部匹配，该溶液使光更少失真地穿透更深，能够更清晰地成像从细胞团簇到完整小鼠大脑的结构与活动。这一进展为使用常规显微镜进行更常规的深层成像以及进行雄心勃勃的实验打开了大门，这些实验可在三维中追踪许多神经元的快速电信号，让我们更接近实时观察完整回路与器官级过程展开的目标。

引用: Inagaki, S., Nakagawa-Tamagawa, N., Huynh, N.Z. et al. Isotonic and minimally invasive optical clearing media for live cell imaging ex vivo and in vivo. Nat Methods 23, 839–853 (2026). https://doi.org/10.1038/s41592-026-03023-y

关键词: 组织增透, 活体成像, 双光子显微镜, 神经活动, 类器官