Milieux optiquement clarifiants isotoniques et peu invasifs pour l’imagerie de cellules vivantes ex vivo et in vivo

Voir plus profondément dans les tissus vivants

La biologie moderne dépend largement des microscopes à fluorescence pour observer des cellules et des organes vivants en action. Pourtant, de nombreux événements les plus intéressants se produisent profondément à l’intérieur de tissus troubles et opaques, où la lumière est rapidement diffusée et floutée. Cet article décrit une nouvelle méthode pour rendre en douceur les tissus mammifères vivants optiquement plus transparents, appelée SeeDB‑Live, permettant aux scientifiques de voir plus loin dans les cerveaux, les organoïdes et les agrégats cellulaires sans empoisonner ni perturber les cellules qu’ils souhaitent étudier.

Pourquoi les tissus vivants sont difficiles à traverser optiquement

Les tissus vivants ne sont pas naturellement transparents parce qu’ils sont composés de nombreuses petites structures — membranes cellulaires, organites, fibres — ayant des propriétés optiques légèrement différentes. Quand la lumière les traverse, elle se réfracte et se diffuse à chaque interface, si bien que les microscopes conventionnels ne parviennent qu’à quelques centaines de micromètres de profondeur dans le cerveau de souris. Les cocktails de « clarification tissulaire » existants résolvent ce problème pour des échantillons fixes et morts en dissolvant les lipides ou en immergeant les tissus dans des liquides denses à indice élevé. Mais ces mélanges sont beaucoup trop agressifs pour des cellules vivantes : ils extraient l’eau des tissus, perturbent l’équilibre ionique ou pénètrent dans les cellules et altèrent leur activité normale, ce qui les rend inadaptés à l’étude des signaux cérébraux naturels ou du fonctionnement des organes.

Une recette douce centrée sur une protéine sanguine

Les auteurs ont raisonnés que s’ils pouvaient égaler la densité optique du milieu extracellulaire à celle du cytosol aqueux à l’intérieur des cellules, la diffusion lumineuse diminuerait et les tissus paraîtraient plus clairs, même vivants. Ils ont testé de nombreux composés, y compris des molécules familières comme la glycérine et diverses agents de contraste médicaux et polymères. Les molécules perméables aux membranes éclaircissaient les cellules mais anéantissaient les réponses calciques normales, un indicateur de santé cellulaire. Les polymères longs et linéaires augmentaient la concentration en sels à des niveaux dommageables. Une observation clé fut que des macromolécules compactes et sphériques, en particulier la protéine sanguine albumine bovine (BSA), pouvaient augmenter l’indice de réfraction du milieu avec très peu de modification de l’osmolarité. En ajustant soigneusement la concentration en BSA et les ions comme le calcium et le magnésium, ils ont obtenu SeeDB‑Live, une solution dont l’indice optique se rapproche de celui de l’intérieur cellulaire tout en maintenant l’équilibre en sels et en eau essentiellement physiologique.

Rendre transparents organoïdes, sphéroïdes et coupes

Avec SeeDB‑Live, l’équipe l’a testé sur des structures vivantes de complexité croissante. Des amas de cellules HeLa dérivées de cancers cultivées en sphéroïdes, ainsi que de petits organoïdes intestinaux et cérébraux, sont rapidement devenus plus transparents sans gonflement ni rétrécissement. Dans des milieux standards, les signaux fluorescents s’estompaient après environ 100 micromètres de profondeur ; dans SeeDB‑Live, les signaux restaient lumineux à plus du double de cette profondeur. Fait important, ces structures continuaient de croître et de répondre à des stimuli tels que du potassium élevé, indiquant que la physiologie de base restait intacte. Des coupes cérébrales aiguës de souris, baignées dans SeeDB‑Live, s’éclaircissaient de la même façon en environ une demi-heure. Les microscopes biphotoniques et confocaux pouvaient alors résoudre neurones, dendrites et structures fines beaucoup plus profondément dans le cortex et l’hippocampe qu’auparavant, et l’« imagerie en ombre » de toutes les cellules d’une coupe devenait réalisable à travers toute l’épaisseur, pas seulement à la surface endommagée.

Préserver la fonction cérébrale tout en voyant davantage

Parce que même de subtils changements d’équilibre ionique peuvent modifier l’activité nerveuse, les auteurs ont mené des tests détaillés sur des coupes cérébrales de souris. Des enregistrements en patch‑clamp de neurones corticaux spécifiques ont montré que le potentiel de repos, les seuils d’excitabilité et les motifs de décharge sous SeeDB‑Live étaient très similaires à ceux mesurés dans le liquide cérébrospinal artificiel standard, avec seulement de modestes décalages de paramètres. L’imagerie calcique dans des coupes du bulbe olfactif a révélé que les motifs d’activité spontanée et évoquée étaient préservés en fréquence et amplitude, même si les signaux devenaient plus lumineux dans les couches profondes. En revanche, d’autres agents candidats comme la glycérine ou l’iodixanol supprimaient le feulement spontané ou ralentissaient la croissance sur plusieurs jours, soulignant la relative douceur de la solution à base de BSA.

Voir dans le cerveau de souris vivant

Les chercheurs sont ensuite passés à des souris vivantes. Après avoir créé une fenêtre crânienne et ouvert délicatement la membrane protectrice, ils ont laissé SeeDB‑Live rincer la surface cérébrale. L’albumine marquée a pénétré d’environ un demi‑millimètre dans le cortex, et l’imagerie biphotonique de neurones fluorescents a montré des signaux jusqu’à trois fois plus lumineux depuis des corps cellulaires profonds. Des structures fines, telles que des épines dendritiques situées à des centaines de micromètres sous la surface, sont devenues nettement visibles. Des tests de locomotion, d’alimentation et de coordination motrice avant et après traitement n’ont montré aucun effet comportemental détectable, et l’inspection microscopique des tissus cérébraux n’a révélé ni poussée d’inflammation ni mort cellulaire, même après traitements répétés sur plusieurs mois.

Élargir ce que nous pouvons mesurer avec la lumière

Grâce à une meilleure clarté, l’équipe a pu aller au‑delà de l’imagerie calcique vers des mesures encore plus exigeantes. Dans des coupes et chez des animaux vivants, ils ont utilisé une imagerie épifluorescente rapide par caméra pour enregistrer des variations de potentiel chez des neurones marqués génétiquement, incluant des potentiels d’action se propageant le long de dendrites et des décharges synchronisées entre cellules apparentées dans le bulbe olfactif. Ces mesures, auparavant limitées par la diffusion et un faible rapport signal/bruit, sont devenues pratiques à des vitesses plus élevées et sur des champs de vue plus larges. Comme SeeDB‑Live est temporaire, le cerveau revient progressivement à son état d’origine lorsque l’albumine est éliminée, et le procédé peut être répété via une simple fenêtre crânienne recouverte de plastique pour des études chroniques.

Ce que cela signifie pour la recherche future sur le cerveau et les organes

Essentiellement, SeeDB‑Live offre un moyen de « dé‑brouillarder » temporairement les tissus mammifères vivants sans perturber notablement le fonctionnement cellulaire. En égalisant les propriétés optiques du fluide intercellulaire à celles de l’intérieur cellulaire, la solution permet à la lumière de pénétrer plus profondément avec moins de distorsion, offrant des images plus nettes de la structure et de l’activité, des agrégats cellulaires aux cerveaux intacts de souris. Cette avancée ouvre la voie à une imagerie profonde plus routinière avec des microscopes standards et à des expériences ambitieuses suivant des signaux électriques rapides à travers de nombreux neurones en trois dimensions, nous rapprochant de l’observation en temps réel de circuits entiers et de processus à l’échelle des organes.

Citation: Inagaki, S., Nakagawa-Tamagawa, N., Huynh, N.Z. et al. Isotonic and minimally invasive optical clearing media for live cell imaging ex vivo and in vivo. Nat Methods 23, 839–853 (2026). https://doi.org/10.1038/s41592-026-03023-y

Mots-clés: clarification tissulaire, imagerie de cellules vivantes, microscopie biphotonique, activité neuronale, organoïdes