Изотоничные и минимально инвазивные оптически просветляющие среды для наблюдения живых клеток ex vivo и in vivo

Заглядывая глубже в живые ткани

Современная биология во многом полагается на флуоресцентные микроскопы, чтобы наблюдать живые клетки и органы в действии. Однако многие наиболее интересные процессы происходят глубоко внутри мутной, непрозрачной ткани, где свет быстро рассеивается и размывается. В этой работе описан новый способ мягко повышать оптическую прозрачность живых тканей млекопитающих — SeeDB-Live, который позволяет ученым видеть дальше в мозг, органоиды и клеточные скопления, не отравляя и не нарушая работу исследуемых клеток.

Почему через живые ткани трудно смотреть

Живые ткани по своей природе не прозрачны, потому что состоят из множества мелких компонент — мембран, органелл, волокон — с немного отличающимися оптическими свойствами. По мере прохождения света он преломляется и рассеивается на каждой границе, поэтому обычные микроскопы видят лишь несколько сотен микрометров вглубь мозга мыши. Существующие «растворы для просветления тканей» решают эту проблему для фиксированных, мёртвых образцов, растворяя липиды или заполняя ткани вязкими средами с высоким показателем преломления. Но эти смеси слишком агрессивны для живых клеток: они вытягивают воду из ткани, нарушают солевой баланс или проникают в клетки и нарушают нормальную активность — поэтому они непригодны для изучения естественных мозговых сигналов или функций органов.

Мягкий рецепт на основе белка крови

Авторы предположили, что если удастся подобрать показатель преломления внеклеточной жидкости, близкий к показателю водного цитозоля внутри клеток, то рассеяние света уменьшится и ткани станут прозрачнее, оставаясь живыми. Они протестировали множество веществ, включая привычные глицерин и разные контрастные вещества и полимеры. Мембрано-проникающие молекулы проясняли клетки, но при этом уничтожали нормальные кальциевые ответы — базовый показатель здоровья клетки. Длинные цепочечные полимеры повышали концентрацию солей до вредных уровней. Важным открытием было то, что компактные шаровидные макромолекулы, в частности сывороточный белок крупного рогатого скота (BSA), способны повысить показатель преломления среды при минимальном изменении осмолярности. Тщательно подобрав концентрацию BSA и ионы, такие как кальций и магний, они получили SeeDB-Live — раствор с оптическим показателем, близким к показателю внутри клетки, при этом поддерживающий солевой и водный баланс практически в физиологическом диапазоне.

Делая органоиды, сфероиды и срезы прозрачными

С SeeDB-Live в руках команда проверила его на всё более сложных живых структурах. Кластеры клеток HeLa, выращенные в виде сфероидов, и миниатюрные кишечные и мозговые органоиды быстро становились более прозрачными без набухания или усадки. В стандартной среде флуоресцентные сигналы угасали примерно через 100 микрометров глубины; в SeeDB-Live сигналы оставались яркими на более чем вдвое больших глубинах. Важно, что эти структуры продолжали расти и реагировать на стимулы, такие как высокий уровень калия, что указывает на сохранение базовой физиологии. Острые мозговые срезы мышей, погружённые в SeeDB-Live, аналогично прояснялись примерно за полчаса. Двухфотонная и конфокальная микроскопия позволили разрешать нейроны, дендриты и тонкие структуры значительно глубже в коре и гиппокампе, а «теневое изображение» всех клеток в срезе стало возможным по всей толщине, а не только у повреждённой поверхности.

Сохранение функций мозга при улучшенном обзоре

Поскольку даже незначительные изменения солевого баланса могут менять нервную активность, авторы провели подробные испытания на срезах мозга мыши. Регистры патч-кламп с отдельных кортикальных нейронов показали, что потенциал покоя, пороги возбуждения и паттерны спайков в SeeDB-Live были очень похожи на таковые в стандартном искусственном спинномозговом ликворе, с лишь умеренными сдвигами параметров. Кальциевая визуализация в срезах обонятельной луковицы продемонстрировала, что спонтанные и вызванные паттерны активности сохраняют частоту и амплитуду, даже когда сигналы становятся ярче на больших глубинах. Напротив, другие кандидаты на роль просветляющих агентов, такие как глицерин и иодиксанол, подавляли спонтанную активность или замедляли рост в течение дней, подчёркивая относительную щадящую природу раствора на основе BSA.

Заглядывание в живой мозг мыши

Затем исследователи перешли к живым мышам. Сделав небольшое окно в черепе и аккуратно открыв защитную оболочку, они позволили SeeDB-Live омыть поверхность мозга. Меченый альбумин проник примерно на полмиллиметра в кору, а двухфотонная визуализация флуоресцентных нейронов показала до трёхкратного усиления сигналов от глубоких тел клеток. Тонкие структуры, такие как дендритные шипики на сотни микрометров ниже поверхности, стали чётко видимы. Тесты на подвижность, кормление и координацию до и после обработки не выявили заметных поведенческих побочных эффектов, а микроскопический осмотр ткани мозга не показал всплеска воспаления или гибели клеток, даже после повторных применений в течение месяцев.

Расширение возможностей оптических измерений

При улучшенной прозрачности команда смогла выйти за рамки кальциевой визуализации к более требовательным показателям. В срезах мозга и в живых животных они использовали быструю камеру для эпифлуоресцентной съёмки изменений потенциала в генетически меченых нейронах, включая потенциалы действия, распространяющиеся по дендритам, и синхронные вспышки между связанными клетками в обонятельной луковице. Эти измерения, ранее ограниченные рассеянием и низким отношением сигнал/шум, теперь стали практичными на более высоких скоростях и на больших полях зрения. Поскольку действие SeeDB-Live временно, мозг постепенно возвращается к исходному состоянию по мере вымывания альбумина, однако процесс можно повторять через простое пластиковое закрытое краниальное окно для длительных исследований.

Что это значит для будущих исследований мозга и органов

По сути, SeeDB-Live предлагает способ временно «рассеять туман» в живых тканях млекопитающих, не нарушая заметно функции их клеток. Подбирая оптические свойства внеклеточной жидкости к свойствам их внутренней среды, раствор позволяет свету проникать глубже с меньшими искажениями, обеспечивая более чёткие изображения структуры и активности — от клеточных скоплений до цельных мозгов мыши. Это достижение открывает путь к более рутинной глубинной визуализации на стандартных микроскопах и к амбициозным экспериментам, отслеживающим быстрые электрические сигналы по многим нейронам в трёх измерениях, приближая нас к наблюдению работы целых цепей и процессов на уровне органов в реальном времени.

Цитирование: Inagaki, S., Nakagawa-Tamagawa, N., Huynh, N.Z. et al. Isotonic and minimally invasive optical clearing media for live cell imaging ex vivo and in vivo. Nat Methods 23, 839–853 (2026). https://doi.org/10.1038/s41592-026-03023-y

Ключевые слова: прояснение тканей, наблюдение живых образцов, двухфотонная микроскопия, нейронная активность, органоиды