Medios de aclaramiento óptico isotónicos y mínimamente invasivos para la imagen de células vivas ex vivo e in vivo

Ver más profundamente en tejidos vivos

La biología moderna depende en gran medida de microscopios fluorescentes para observar células y órganos vivos en acción. Sin embargo, muchos de los eventos más interesantes ocurren en lo profundo de tejidos turbios y opacos, donde la luz se dispersa y difumina rápidamente. Este artículo describe una nueva forma de hacer que tejidos de mamíferos vivos sean ópticamente más claros de manera suave, llamada SeeDB-Live, lo que permite a los científicos ver más adentro del cerebro, organoides y agrupaciones celulares sin envenenar ni perturbar las células que desean estudiar.

Por qué los tejidos vivos son difíciles de atravesar

Los tejidos vivos no son naturalmente transparentes porque están formados por muchas partes diminutas —membranas celulares, orgánulos, fibras— con propiedades ópticas ligeramente diferentes. Cuando la luz los atraviesa, se desvía y se dispersa en cada límite, por lo que los microscopios convencionales solo pueden ver unos pocos cientos de micrómetros en el cerebro del ratón. Los cócteles de “aclaramiento de tejidos” existentes solucionan esto en muestras fijadas y muertas disolviendo lípidos o empapando tejidos en líquidos densos de alto índice. Pero estas mezclas son demasiado agresivas para las células vivas: extraen agua de los tejidos, alteran el equilibrio de sales o se filtran en las células y perturban la actividad normal, haciéndolas inadecuadas para estudiar señales cerebrales o funciones de órganos en condiciones naturales.

Una receta suave basada en una proteína plasmática

Los autores plantearon que si podían igualar la densidad óptica del fluido fuera de las células con la del citosol acuoso en su interior, la luz se dispersaría menos y los tejidos parecerían más claros, incluso viviéndose. Examinaron muchos químicos, incluidos algunos habituales como la glicerina y una variedad de agentes de contraste médicos y polímeros. Las moléculas permeables a membrana aclaraban las células pero borraban las respuestas normales de calcio, una señal básica de salud celular. Los polímeros largos y en cadena aumentaban la concentración de sales a niveles dañinos. Una idea clave fue que macromoléculas compactas y esféricas, especialmente la proteína sanguínea albúmina bovina (BSA), podían aumentar el índice de refracción del medio con muy poco cambio en la osmolaridad. Ajustando cuidadosamente la concentración de BSA y iones como calcio y magnesio, desarrollaron SeeDB-Live, una solución cuyo índice óptico coincide estrechamente con el del interior celular mientras mantiene el equilibrio de sales y agua esencialmente fisiológico.

Haciendo transparentes organoides, esferoides y cortes

Con SeeDB-Live en mano, el equipo lo probó en estructuras vivas de complejidad creciente. Agrupaciones de células HeLa derivadas de cáncer, cultivadas como esferoides, y mini organoides intestinales y cerebrales se volvieron rápidamente más transparentes sin hincharse ni encogerse. En medios estándar, las señales fluorescentes se atenuaban alrededor de 100 micrómetros de profundidad; en SeeDB-Live, las señales se mantuvieron brillantes a más del doble de esa profundidad. Es importante que estas estructuras continuaron creciendo y respondiendo a estímulos como potasio alto, lo que indica que la fisiología básica permaneció intacta. Cortes agudos de cerebro de ratón, bañados en SeeDB-Live, se aclararon de forma similar en aproximadamente media hora. Microscopías multiphotón y confocal pudieron entonces resolver neuronas, dendritas y estructuras finas mucho más profundas en corteza e hipocampo que antes, y la “imagen por sombra” de todas las células en un corte se hizo factible a lo largo de todo el espesor, no solo en la superficie dañada.

Preservar la función cerebral mientras se ve más

Dado que incluso cambios sutiles en el equilibrio de sales pueden alterar la actividad nerviosa, los autores realizaron pruebas detalladas en cortes cerebrales de ratón. Registros de patch-clamp en neuronas corticales específicas mostraron que el voltaje de reposo, los umbrales de disparo y los patrones de picos bajo SeeDB-Live eran muy similares a los obtenidos en el fluido cerebroespinal artificial estándar, con solo desplazamientos modestos de parámetros. La imagen de calcio en cortes de bulbo olfatorio reveló que los patrones de actividad espontánea y evocados se preservaron en frecuencia y amplitud, incluso cuando las señales se hicieron más brillantes en capas profundas. En contraste, otros agentes candidatos de aclaramiento como glicerol e iodixanol o bien suprimieron el disparo espontáneo o ralentizaron el crecimiento a lo largo de días, subrayando la relativa sutileza de la solución a base de BSA.

Ver dentro del cerebro de un ratón vivo

Los investigadores pasaron luego a ratones vivos. Tras crear una pequeña ventana en el cráneo y abrir con cuidado la membrana protectora, permitieron que SeeDB-Live fluyera sobre la superficie cerebral. La albúmina marcada penetró aproximadamente medio milímetro en la corteza, y la imagen multiphotón de neuronas fluorescentes mostró señales hasta tres veces más brillantes en cuerpos celulares profundos. Estructuras finas, como espinas dendríticas a cientos de micrómetros bajo la superficie, se hicieron visiblemente nítidas. Pruebas de movimiento, alimentación y coordinación motora antes y después del tratamiento no mostraron efectos conductuales detectables, y la inspección microscópica del tejido cerebral no reveló un aumento de inflamación o muerte celular, incluso tras tratamientos repetidos durante meses.

Ampliando lo que podemos medir con luz

Con mayor claridad, el equipo pudo ir más allá de la imagen de calcio hacia lecturas aún más exigentes. En cortes cerebrales y en animales vivos, usaron epifluorescencia rápida basada en cámara para registrar cambios de voltaje en neuronas marcadas genéticamente, incluyendo potenciales de acción que viajaban por dendritas y disparos sincronizados entre células relacionadas en el bulbo olfatorio. Estas mediciones, previamente limitadas por la dispersión y la baja relación señal-ruido, se volvieron ahora prácticas a mayores velocidades y sobre campos de visión más amplios. Dado que SeeDB-Live es transitorio, el cerebro regresa gradualmente a su estado original a medida que la albúmina se elimina, aunque el proceso puede repetirse mediante una simple ventana craneal cubierta con plástico para estudios crónicos.

Qué significa esto para la investigación futura del cerebro y los órganos

En esencia, SeeDB-Live ofrece una forma de “desempañar” temporalmente tejidos mamíferos vivos sin alterar de forma apreciable el funcionamiento de sus células. Al igualar las propiedades ópticas del fluido intercelular con las de su interior, la solución permite que la luz penetre más profundamente con menos distorsión, posibilitando imágenes más claras de la estructura y la actividad en todo, desde agrupaciones celulares hasta cerebros de ratón intactos. Este avance abre la puerta a una imagen profunda más rutinaria usando microscopios estándar y a experimentos ambiciosos que sigan señales eléctricas rápidas a través de muchas neuronas en tres dimensiones, acercándonos a observar circuitos completos y procesos a escala de órgano en tiempo real.

Cita: Inagaki, S., Nakagawa-Tamagawa, N., Huynh, N.Z. et al. Isotonic and minimally invasive optical clearing media for live cell imaging ex vivo and in vivo. Nat Methods 23, 839–853 (2026). https://doi.org/10.1038/s41592-026-03023-y

Palabras clave: aclaramiento de tejidos, imagen en vivo, microscopía multiphotón, actividad neuronal, organoides