Codifica ottica multiplexata e sequenziamento per omiche spaziali

Vedere dove vivono le molecole nei tessuti

I nostri corpi sono composti da molti tipi di cellule organizzate in schemi precisi, e questi schemi sono rilevanti per la salute e la malattia. Gli scienziati dispongono di strumenti potenti per misurare quali geni sono attivi nelle cellule, ma questi strumenti spesso perdono l’informazione riguardo al punto del tessuto da cui proviene ciascuna misura. Questo articolo presenta un nuovo metodo, chiamato MOLseq, che mira a conservare entrambe le informazioni simultaneamente: cosa fa ogni cellula e dove si trova esattamente.

Perché la posizione conta per le molecole

Negli ultimi anni le “omiche spaziali” hanno cambiato il modo in cui i ricercatori studiano i tessuti. Invece di analizzare le cellule isolate, gli scienziati chiedono ora quali geni sono attivi in ciascuna cellula mentre questa rimane nel suo contesto originario. Gli approcci esistenti ricadono grosso modo in due categorie. I metodi di imaging usano microscopi e sonde fluorescenti per visualizzare direttamente migliaia di molecole nelle cellule con dettagli molto fini, spesso fino a strutture subcellulari. Ma di solito richiedono di scegliere in anticipo quali geni osservare. I metodi di sequenziamento, al contrario, possono leggere virtualmente tutti i geni attivi contemporaneamente, ma tipicamente amalgamano segnali provenienti da molte cellule e registrano le posizioni solo su griglie bidimensionali grossolane. Di conseguenza, i ricercatori spesso devono scegliere tra ampiezza dell’informazione e precisione spaziale.

Un sistema di indirizzamento controllato dalla luce

MOLseq offre un modo per combinare l’ampiezza del sequenziamento con il controllo fine della luce. L’idea centrale è assegnare alle molecole all’interno delle cellule una sorta di “codice postale” che registri la loro posizione, per poi leggere sia il codice postale sia l’identità genica tramite sequenziamento. Per prima cosa, il metodo lega un breve primer di DNA agli RNA messaggeri all’interno di cellule fissate e converte questi RNA in copie di DNA. Poi, usando un dispositivo simile a un proiettore che illumina con luce ultravioletta (UV) con pattern specifici, MOLseq aggiunge brevi “lettere” di DNA a queste copie soltanto nelle regioni illuminate. Ogni impulso di luce aggiunge esattamente una lettera, e la sequenza di lettere costruisce un codice a barre unico per ciascuna posizione. Dopo varie ripetizioni, le molecole provenienti da regioni diverse portano codici a barre diversi, che fungono da indirizzi spaziali quando il campione viene poi frammentato e sequenziato.

Poiché i codici a barre si costruiscono passo dopo passo, il numero di indirizzi possibili cresce rapidamente con il numero di lettere e di cicli. Gli autori mostrano che la loro chimica indotta dalla luce può aggiungere lettere in serie con circa il 90% di successo per passaggio, e che più lettere possono essere gestite in parallelo usando filamenti ausiliari progettati. In esperimenti su colture cellulari, hanno generato centinaia di codici a barre distinti in situ e hanno confermato le lunghezze previste dei codici usando uno strumento di sizing del DNA. È importante che abbiano anche progettato schemi di codifica in grado di segnalare e correggere alcuni errori, migliorando l’affidabilità anche quando singoli passaggi non sono perfetti.

Scrivere codici a barre cellula per cellula

Una promessa chiave di MOLseq è il controllo preciso su dove i codici a barre vengono scritti. Guidando la luce UV con un dispositivo a microspecchi digitale, il gruppo ha fotolegato e legato selettivamente le lettere in regioni che andavano da ampie aree fino a singole cellule. Hanno usato sonde fluorescenti per visualizzare dove le lettere erano state aggiunte, mostrando che cellule adiacenti a pochi micrometri di distanza ricevevano quasi nessun segnale indesiderato. In un esperimento sono riusciti ad assegnare con successo codici a barre unici di tre lettere a 64 singole cellule nello stesso vetrino. La modellizzazione dei dati ha indicato che la probabilità che una lettera venga aggiunta fuori bersaglio in ogni ciclo era solo di pochi punti percentuali, mentre il tasso di aggiunta previsto sul bersaglio rimaneva elevato.

Per verificare se questi codici a barre possono guidare letture geniche complete, i ricercatori hanno mescolato cellule umane e murine in regioni separate sullo stesso vetrino e hanno applicato MOLseq. Hanno costruito codici a barre distinti di due lettere per le regioni umane e murine, confermato la separazione spaziale tramite imaging e poi sequenziato il materiale codificato. Le letture che portavano il codice a barre della “regione umana” si mappavano in gran parte su geni umani, e quelle con il codice della “regione murina” sui geni del topo. La piccola frazione di apparenti mix-up era simile a quanto ci si aspetta dalla somiglianza naturale di sequenza tra le due specie, suggerendo che la maggior parte degli errori non derivava dal processo di codifica ma dalle ambiguità inevitabili nel mapping delle letture.

Promesse e prossimi passi

Unendo la modulazione della luce con il sequenziamento del DNA, MOLseq indica un futuro in cui gli scienziati potranno scandire ampie aree di tessuto, catturare l’attività di molti geni senza preselezione e sapere comunque da dove proviene ciascun segnale—potenzialmente fino alla singola cellula. La versione attuale affronta ancora sfide: effetti di luce fuori bersaglio, efficienza limitata con molti cicli di ligazione e la difficoltà di catturare RNA a sufficienza da regioni molto piccole. Tuttavia lo studio dimostra che la codifica ottica multiplexata è pratica e accurata nelle cellule in coltura e delinea percorsi realistici per aumentare la diversità dei codici a barre e la correzione degli errori. Per il lettore, la conclusione è che strumenti come MOLseq potrebbero presto permettere ai ricercatori di creare ‘‘mappe molecolari’’ dettagliate dei tessuti, rivelando come le posizioni delle cellule e l’attività genica lavorino insieme nello sviluppo, nelle funzioni cerebrali, nel cancro e in molti altri processi biologici.

Citazione: Venkatramani, A., Ciftci, D., Pham, K. et al. Multiplexed optical barcoding and sequencing for spatial omics. Sci Rep 16, 14086 (2026). https://doi.org/10.1038/s41598-026-41186-y

Parole chiave: omiche spaziali, codifica ottica, trascrittomica, profilazione a singola cellula, sequenziamento del DNA