Разработка и валидация обычного и TaqMan ПЦР в реальном времени для обнаружения Trichoderma afroharzianum, вызывающего гниль початков кукурузы

Скрытая угроза на кукурузных полях

Кукуруза — основной продукт питания и корм для животных во многих странах, но вновь появившееся заболевание незаметно повреждает початки кукурузы в Европе и за её пределами. Возбудитель — гриб Trichoderma afroharzianum, который способен вызывать гниль початков и снижать урожай. Поскольку симптомы могут напоминать другие распространённые болезни початков, агрономам и консультантам нужен быстрый и надёжный метод, чтобы определить присутствие именно этого гриба. В данном исследовании описано, как учёные разработали и протестировали точный ДНК-ориентированный тест, позволяющий выявить гриб на ранней стадии, ещё до появления видимых признаков.

Почему полезный гриб стал проблемой

Грибы рода Trichoderma обычно рассматриваются как полезные: они живут в почве и на растениях и широко используются в биологической защите культур от других болезней. Тем не менее в 2018 году на юге Германии был обнаружен новый тип гнили початков, и тщательное исследование показало, что причиной стал T. afroharzianum. С тех пор подобные вспышки гнили были отмечены в ряде европейских стран и в Китае. Некоторые близкие виды Trichoderma также ассоциировались с гнилью стеблей кукурузы. Поскольку визуальные признаки пересекаются с другими гнилями початков, опираться только на осмотр поля рискованно: можно пропустить это новое заболевание или принять его за более известную проблему.

Создание ДНК‑теста по «отпечатку»

Чтобы решить эту задачу, команда разработала два лабораторных теста на основе ПЦР — стандартного метода для копирования и обнаружения ДНК. Один — обычная ПЦР с визуализацией результата в виде полосы на геле; другой — более чувствительная ПЦР в реальном времени «TaqMan», которая отслеживает нарастание ДНК в процессе реакции. Исследователи выбрали два гена, особенно пригодных для различения близкородственных видов Trichoderma. Для обычной ПЦР целевым оказался ген TEF1α, а для ПЦР в реальном времени — ген RPB2. Затем они создали специфические короткие участки ДНК (праймеры и зонд), которые совпадают только с ДНК T. afroharzianum, как замок, рассчитанный на единственный ключ.

Испытание теста в полевых и лабораторных условиях

Учёные собрали большую коллекцию грибных образцов с початков, стеблей, почвы, других растений и коммерческих продуктов, в основном из Германии, а также из Франции, Италии, Перу и других стран. Коллекция включала множество штаммов T. afroharzianum — как патогенных для кукурузы, так и непатогенных — а также многочисленные другие виды Trichoderma и несвязанные грибы. Оба ПЦР‑теста корректно выявили все образцы T. afroharzianum и исключили практически все неприцеленные виды. Обычная ПЦР надёжно детектировала количество целевой ДНК до одной триллионной доли грамма на микролитр, тогда как ПЦР в реальном времени была в тысячу раз чувствительнее — до одной квадриллионной доли грамма. Важно, что оба теста работали не только на чистых культурах гриба, но и непосредственно на ДНК, выделенной из инфицированных зерен кукурузы, включая початки, которые внешне казались здоровыми.

Как тест помогает фермерам и исследователям

Новый диагностический инструмент соответствовал строгим критериям качества, демонстрируя высокую точность, воспроизводимость и устойчивость при использовании на разных приборах и в различных реакционных условиях. Версия в реальном времени оказалась особенно полезной для раннего выявления и для более детального мониторинга, например при проверке образцов почвы с полей кукурузы для оценки риска заболевания до посева. Однако тесты пока не позволяют различать штаммы T. afroharzianum, вредные для кукурузы, и штаммы, безвредные или полезные в других условиях, таких как биопрепараты. Это означает, что положительный результат в образце без видимых симптомов следует интерпретировать осторожно и при необходимости дополнять тестами на способность штамма вызывать заболевание.

Что это значит для защиты кукурузы

Проще говоря, это исследование даёт новый «увеличительный объектив» для обнаружения трудноуловимого заболевания кукурузы. Прямое считывание генетического кода гриба в образцах растений или почвы позволяет двум ПЦР‑тестам быстро и точно идентифицировать T. afroharzianum, без задержек, связанных с выращиванием гриба в культуре или опираясь на сходные визуальные симптомы. Раннее и надёжное обнаружение облегчает отличение этого заболевания от других гнилей початков и более целенаправленное проведение защитных мероприятий, помогая фермерам снижать потери урожая и ограничивать распространение. По мере того как учёные будут лучше понимать, что делает одни штаммы вредными, а другие — безопасными, такие инструменты также помогут безопасному использованию продуктов на основе Trichoderma в устойчивом сельском хозяйстве.

Цитирование: Douanla-Meli, C., Pfordt, A., von Tiedemann, A. et al. Development and validation of conventional and TaqMan real-time PCR for the detection of Trichoderma afroharzianum causing corn ear rot. Sci Rep 16, 14427 (2026). https://doi.org/10.1038/s41598-026-51199-2

Ключевые слова: гниль початков кукурузы, Trichoderma afroharzianum, диагностика болезней растений, ПЦР-тестирование, здоровье кукурузы