Влияние повторных циклов замораживания и оттаивания на стабильность состава фекального микробиома

Почему замороженный кал важен для медицинских исследований

Крупные медицинские исследования по всему миру накапливают образцы замороженного кала, чтобы понять, как кишечные бактерии влияют на всё — от ожирения до рака. Но многие из этих ценных образцов неоднократно оттаивают и снова замораживают по мере появления новых вопросов и технологий. В этом исследовании задают практичный, но важный вопрос: сколько раз можно безопасно заморозить и оттаять образец кала, прежде чем картина микробиома кишечника начнёт искажаться?

Как на самом деле обращаются с образцами кишечника в лаборатории

В идеале учёные проанализировали бы кал сразу после его образования. На практике люди собирают образцы дома, кратковременно хранят их в холодильнике, а затем отправляют в лабораторию, где их замораживают для длительного хранения. Когда исследователям позже нужны новые анализы, им приходится оттаивать образец, отбирать небольшую часть и снова замораживать остальное. Каждый цикл замораживания–оттаивания может повредить бактериальные клетки и их ДНК, что потенциально искажает представление о том, какие микроорганизмы присутствуют. Предыдущие исследования дали противоречивые результаты и часто использовали мелких животных, младенцев или устаревшие лабораторные методы, которые не полностью соответствуют современным крупным исследованиям на людях.

Проверка повторного замораживания

Исследователи привлекли пяти здоровых взрослых в возрасте от 25 до 50 лет, у которых не было недавних проблем с кишечником и не применялись антибиотики. Каждый человек предоставил образец кала, который тщательно перемешали и разделили. Одна часть была обработана немедленно, чтобы зафиксировать «свежий» микробиом. Остальные образцы были заморожены при очень низкой температуре. Каждые несколько дней пробирку медленно согревали ровно настолько, чтобы отделить небольшой кусочек для экстракции ДНК, затем возвращали обратно в глубокую заморозку. Это повторяли по шесть раз для каждого человека. Затем команда секвенировала бактериальную ДНК из каждой точки времени, используя распространённый метод по генному маркеру, который определяет, какие группы микроорганизмов присутствуют и в каком соотношении.

Микробное разнообразие остаётся удивительно стабильным

В течение шести циклов замораживания–оттаивания общая богатость и баланс кишечных микробов в каждом образце изменялись очень мало. Показатели разнообразия внутри образца и различий между образцами оставались стабильными. При визуализации закономерностей во всех образцах с помощью статистических инструментов главным фактором, разделяющим образцы, оказался не срок замораживания, а индивидуальность донора. Иными словами, личный микробный отпечаток оказался гораздо важнее истории заморозок. Выход ДНК действительно снизился после первого замораживания, но затем оставался стабильным, что указывает на то, что объёма пригодного генетического материала всё ещё достаточно для надёжного анализа.

Небольшие сдвиги проявляются только после многих циклов

При более тщательном анализе отдельных групп бактерий команда проверила, повышались ли или снижались конкретные типы при повторном замораживании. Очень консервативный аналитический подход не обнаружил значимых изменений даже после шести циклов. Более чувствительный метод выявил скромные сдвиги в небольшой доле бактериальных групп. Эти изменения появлялись в основном после четырёх или более циклов и были наиболее заметны в одной широкой группе кишечных бактерий, известной своей относительно хрупкой природой. Некоторые другие группы, наоборот, казались немного увеличившимися с течением времени. Однако поскольку эти сигналы не проявлялись последовательно во всех методах, авторы предупреждают, что по крайней мере часть наблюдаемых изменений может быть ложной тревогой, а не истинным биологическим эффектом.

Что это значит для хранилищ образцов кала

Для тех, кто проектирует или повторно использует крупные исследования микробиома, вывод обнадёживает. Когда образцы кала здоровых взрослых медленно оттаивают и быстро снова замораживают, общая картина микробиома кишечника остаётся высоко воспроизводимой по крайней мере в течение трёх циклов замораживания–оттаивания. Личные различия между донорами перевешивают любые эффекты замораживания. После примерно четырёх циклов в некоторых бактериальных группах могут появиться тонкие изменения, поэтому частое повторное использование одной и той же пробирки со временем может постепенно снижать точность. В целом исследование поддерживает повторный анализ образцов, которые были оттаявшими один или несколько раз, что позволяет извлечь гораздо больше научной пользы из уже имеющихся замороженных коллекций, не привлекая новых участников для каждого нового вопроса.

Цитирование: Sangermani, M., Desiati, I., Quattrini, N. et al. Effects of repeated freeze and thaw cycles on the stability of faecal microbiome composition. Sci Rep 16, 9880 (2026). https://doi.org/10.1038/s41598-026-39939-w

Ключевые слова: микробиом кишечника, образцы калла, хранение образцов, циклы замораживания и оттаивания, секвенирование микробиома