Effetti dei cicli ripetuti di congelamento e scongelamento sulla stabilità della composizione del microbioma fecale

Perché le feci congelate contano nella ricerca sulla salute

Grandi studi sanitari in tutto il mondo accumulano campioni di feci congelate per capire come i batteri intestinali influenzino tutto, dall’obesità al cancro. Ma molti di questi campioni preziosi vengono scongelati e ricongelati man mano che emergono nuove domande e nuove tecnologie. Questo studio pone una domanda pratica ma cruciale: quante volte si può congelare e scongelare in sicurezza un campione di feci prima che l’immagine del microbioma intestinale inizi a offuscarsi?

Come vengono gestiti davvero i campioni intestinali in laboratorio

In un mondo ideale, gli scienziati analizzerebbero le feci immediatamente dopo la produzione. In realtà, le persone raccolgono i campioni a casa, li conservano brevemente in frigorifero e poi li inviano a un laboratorio, dove vengono congelati per la conservazione a lungo termine. Quando i ricercatori vogliono eseguire nuovi test, devono scongelare il campione, prelevare una piccola porzione e ricongelare il resto. Ogni ciclo di congelamento–scongelamento potrebbe danneggiare le cellule batteriche e il loro DNA, dando una visione distorta di quali microrganismi siano presenti. Studi precedenti hanno fornito messaggi contrastanti e spesso hanno usato piccoli animali, neonati o metodi di laboratorio datati che non corrispondono pienamente agli attuali grandi studi su persone.

Mettere alla prova i congelamenti ripetuti

I ricercatori hanno reclutato cinque adulti sani, di età compresa tra 25 e 50 anni, senza problemi intestinali recenti né uso di antibiotici. Ogni persona ha fornito un campione di feci che è stato accuratamente miscelato e suddiviso. Una porzione è stata processata immediatamente per catturare il microbioma “fresco”. Il resto è stato congelato a temperature molto basse. Ogni pochi giorni, la provetta congelata è stata riscaldata lentamente quel tanto che basta per staccarne un piccolo pezzo per l’estrazione del DNA, quindi rimessa in congelamento profondo. Questo è stato ripetuto sei volte per persona. Il team ha quindi sequenziato il DNA batterico di ciascun punto temporale, usando un metodo comune basato su geni che identifica quali gruppi microbici sono presenti e quanto sono abbondanti.

La diversità microbica resta sorprendentemente stabile

Durante i sei cicli di congelamento–scongelamento, la ricchezza complessiva e l’equilibrio dei microbi intestinali in ciascun campione sono variati molto poco. Le misure della diversità all’interno di ogni campione, e le differenze tra campioni, sono rimaste stabili. Quando i ricercatori hanno utilizzato strumenti statistici per visualizzare i modelli attraverso tutti i campioni, il fattore principale che li separava non era il numero di volte in cui erano stati congelati, ma la persona di provenienza. In altre parole, l’impronta microbica personale rimaneva molto più importante di qualsiasi storia di congelamento. La resa di DNA è diminuita dopo il primo congelamento, ma poi è rimasta stabile, suggerendo che la quantità di materiale genetico utile era comunque sufficiente per analisi affidabili.

Piccoli cambiamenti emergono solo dopo molti cicli

Esaminando più da vicino gruppi batterici individuali, il team ha verificato se tipi specifici aumentassero o diminuissero con i congelamenti ripetuti. Un metodo analitico molto prudente non ha rilevato cambiamenti significativi nemmeno dopo sei cicli. Un metodo più sensibile ha invece individuato spostamenti modesti in una piccola frazione di gruppi batterici. Questi cambiamenti sono apparsi principalmente dopo quattro o più cicli e sono stati più evidenti in un ampio gruppo di batteri intestinali noto per essere relativamente fragile. Altri gruppi sembravano aumentare leggermente nel tempo. Tuttavia, poiché questi segnali non sono comparsi in modo coerente con tutti i metodi, gli autori avvertono che almeno alcuni di questi apparenti cambiamenti potrebbero essere falsi allarmi piuttosto che veri effetti biologici.

Cosa significa per le collezioni di campioni di feci conservate

Per chi progetta o riutilizza grandi studi sul microbioma, il messaggio è rassicurante. Quando i campioni di feci di adulti sani vengono scongelati lentamente e ricongelati rapidamente, l’immagine complessiva del microbioma intestinale rimane altamente riproducibile per almeno tre cicli di congelamento–scongelamento. Le differenze personali tra individui predominano su qualsiasi effetto del congelamento. Dopo circa quattro cicli, cambiamenti sottili in alcuni gruppi batterici possono insorgere, quindi il riutilizzo intensivo della stessa provetta potrebbe gradualmente ridurre l’accuratezza. In generale, lo studio supporta la ri-analisi sicura di campioni già scongelati una o poche volte, aprendo la possibilità di ottenere molto più valore scientifico dalle collezioni congelate esistenti senza dover reclutare nuovi volontari per ogni nuova domanda.

Citazione: Sangermani, M., Desiati, I., Quattrini, N. et al. Effects of repeated freeze and thaw cycles on the stability of faecal microbiome composition. Sci Rep 16, 9880 (2026). https://doi.org/10.1038/s41598-026-39939-w

Parole chiave: microbioma intestinale, campioni di feci, conservazione dei campioni, cicli di congelamento e scongelamento, sequenziamento del microbioma