将 HUH 标签的 Cas9 用作通过胚胎和成虫注射进行高效 ssODN 介导敲入的平台（昆虫）

让昆虫基因编辑更容易

昆虫塑造了我们的世界，从授粉作物到传播疾病，但科学家在精确改写它们的 DNA 时仍面临困难，尤其是在那些难以在实验室饲养或操作的物种中。本文介绍了一种改良的 CRISPR 基因编辑工具，使在广泛的昆虫中通过对成虫或胚胎进行简单注射来插入或删除特定遗传序列变得更加容易。通过提高基因编辑的效率和实用性，这项工作为研究昆虫生物学、控制害虫以及开发新的研究模式物种打开了大门。

为何编辑昆虫基因如此棘手

CRISPR-Cas9 已经革新了遗传学，但多数昆虫实验仍依赖脆弱的早期胚胎注射。这种方法需要专用设备、精确计时的产卵收集和相当的技术熟练度，且通常仅在少数研究透彻的物种中有效。一种被称为成虫注射的较新方法可以绕过其中一些障碍：研究人员可以将制备好的 Cas9 蛋白和导向 RNA 注入成虫雌体，它们的后代就会出现编辑结果。虽然这种捷径在基因敲除——通过引入小的 DNA 断裂来破坏基因方面表现良好，但在更具挑战性的基因敲入任务中效果较差，后者需要在精确位置插入新的 DNA 序列。

小蛋白标签的大影响

作者们着手通过将修复 DNA 与 Cas9 物理连接来增强这一精确步骤，使得当 Cas9 切割基因组时，正确的模板已在位。他们使用了一段称为 HUH 标签的蛋白片段，来源于名为 PCV Rep 的病毒蛋白，该蛋白天然能与携带短识别序列的单链 DNA 形成共价键。通过将该 PCV 标签融合到 Cas9，并在修复 DNA（简短的单链寡核苷酸）上加入一个 13 个碱基的识别片段，他们创建了一个能将修复模板直接带到断裂位点的 Cas9 复合体。为便于生产和纯化这种融合蛋白，他们还连接了一个改善溶解性的 SUMO 标签，并精心优化了三步纯化方案，以获得高活性的蛋白质制剂。

在甲虫、蟋蟀和臭虫中更强的编辑效果

在红面粉甲虫中测试他们改造的 Cas9 时，研究团队发现 PCV 标签融合体不仅有效，而且令人惊讶地使基础基因敲除效率相比无标签 Cas9 提高了多达五倍。对昆虫细胞培养的后续实验揭示了原因：PCV 标签携带内建信号，可将 Cas9 吸引入细胞核（DNA 所在处），从而增加成功编辑的机会。当他们在成虫甲虫中使用牵引的修复 DNA 时，将一个微小标记序列精确“敲入”到眼色基因的比率提高了约两到三倍，许多被编辑的个体在其细胞中携带了高比例的目标等位基因。

专注于精确的 DNA 插入

随后，团队探讨了相同策略在更传统的胚胎注射中是否有效，使用了两种远缘亲缘关系的昆虫：二斑蟋蟀和乳草虫。在蟋蟀中，他们旨在向一个对变态发育必需的基因添加一个小的表位标签——一种能被抗体识别的短蛋白序列。使用商业 Cas9 时，只有大约九个胚胎中有一个在两个接合位点都携带正确插入。使用 SUMO-PCV-Cas9 融合体和牵引修复寡核苷酸后，这一比例跃升至近五分之二，并且一些个体仅携带精确的敲入序列而无可检测的副产物。在乳草虫中，他们用类似策略标记了一个参与生殖腺发育的基因，获得了大约两倍于标准 Cas9 的敲入效率，并成功将编辑等位基因传递到下一代。显微镜检查证实，带标签的蛋白出现在该基因正常发挥作用的相同组织中，表明这些编辑既精确又具有功能性。

这对未来昆虫研究意味着什么

总体而言，这些结果表明，将 HUH 标签附加到 Cas9 提供了一种简单且广泛适用的方法，使昆虫基因组编辑更强大、更易获得。该标签有助于将 Cas9 拉入细胞核并将修复 DNA 锁定到切割酶上，从而在对现有方案做出最小改动的情况下同时改善基因敲除和精确基因插入。由于该方法既适用于成虫注射也适用于胚胎注射，并且只需在修复 DNA 上添加一段短序列，就可以适配多种昆虫和节肢动物物种，从新兴的实验室模式到农业害虫和疾病媒介。对非专业人士而言，结论是：一个小小的蛋白附加件已将这一已具变革性的基因编辑工具变成了一个更精确、也更实用的手段，用以探索——并可能管理——昆虫世界。

引用: Shirai, Y., Kao, J.A., Kumar, T. et al. HUH-tagged Cas9 as a platform for efficient ssODN-mediated knock-in via embryo and adult injection in insects. Commun Biol 9, 514 (2026). https://doi.org/10.1038/s42003-026-09777-7

关键词: 昆虫基因组编辑, CRISPR-Cas9, 敲入效率, HUH 标签 PCV, 成虫注射方法