基于大肠杆菌“搭便车”转运改良的蛋白质筛选策略及通过选择识别牛干扰素γ的纳米抗体进行验证

为何微小抗体与牛群健康重要

牛结核病是一种传染性疾病，威胁着牛群以及依赖牛群获取食物和收入的人群。早期发现感染至关重要，但现有血液检测依赖常规抗体和进口试剂盒，这些试剂在许多国家价格高昂且难以及时获得。本研究描述了一种利用细菌和酵母而非动物或昂贵设备来发现一种较新型“迷你抗体”——纳米抗体的方法。该工作不仅产生了可识别牛重要免疫信号——牛干扰素γ的纳米抗体，还改进了细菌筛选方法，使其更准确、可扩展，且适合资源有限的实验室使用。

从传统抗体到微小多面手

常规抗体是诊断和治疗中的强大工具，但它们体积大、结构复杂，通常需要在动物体内制备，这使得其成本高、耗时长且依赖专业动物设施。纳米抗体来自骆驼科动物的重链抗体，将抗体的结合部分缩减为单一、紧凑的结构域。尽管体积小，纳米抗体仍可具有高度特异性和稳定性，更易于工程改造，并且可在细菌中廉价大量生产。挑战在于如何从海量潜在纳米抗体序列中筛选出那些对目标蛋白具有高亲和力和特异性结合的序列。

构建更智能的细菌筛选引擎

作者改进了一种名为FLI-TRAP的现有系统，该系统将大肠杆菌的天然“搭便车”转运通路转化为一个活体筛选平台，用于筛选结合蛋白。在FLI-TRAP中，候选纳米抗体被融合到一个信号肽上，信号肽在将蛋白从细菌细胞质转运到位于内膜外侧的过氧化腔（periplasm）时，可以“带走”任何结合伙伴。目标蛋白则与一种能够破坏β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺酶融合。当纳米抗体与其目标结合时，该复合体被共同转运，酶到达过氧化腔，细胞因此能在含抗生素的培养基上存活。结合越强、越可溶，存活越好。早期的FLI-TRAP版本要么产出目标蛋白太少，要么易受到“假阳性”影响——克隆过程中产生的快捷融合体在没有真实纳米抗体–目标结合的情况下也能赋予抗生素抗性。

去除假阳性并增强真实结合体

为了解决这些问题，团队重新设计了同时表达纳米抗体和目标-酶融合体的“双顺反子”质粒。他们将两个蛋白基因的顺序倒置，并调整核糖体结合位点，使得牛干扰素γ–β-内酰胺酶融合体能从首位高效表达，而纳米抗体融合体从第二位表达。这样的布局大大降低了简单DNA插入或缺失产生直接信号肽–酶融合体、绕过纳米抗体结合需求的可能性。作者确认新构建体能产生丰富且可溶的目标融合体，不像低产的单顺反子版本。当他们比较原始与改良系统时，只有新设计成功获得了针对牛干扰素γ的真实纳米抗体结合体，而非源于基因失误的伪影。

寻找并测试针对关键结核标志物的纳米抗体

作为现实世界的验证，研究人员以牛干扰素γ为目标——这是一种在牛结核血检中常被测量的免疫信使。他们从一个大型、完全合成的纳米抗体文库开始，该文库在酵母细胞表面展示，其中只有抗原结合环可变，而结构框架保持不变。一次磁性分选（MACS）富集了那些其展示的纳米抗体能结合牛干扰素γ的酵母细胞，将文库缩小为更聚焦的集合。随后将富集池中的基因转入大肠杆菌，并在改良的FLI-TRAP系统上进行抗生素平板筛选。从最终的菌落中，团队鉴定出四种不同的全长纳米抗体。其中两种，命名为B7和N5，在优化的pH条件下在酶联免疫检测中表现出特别强且特异的结合，并且与不相关蛋白的交叉反应性很低。

迈向为农户和兽医提供的可负担检测

详细的生物物理测定显示，B7以纳摩尔亲和力结合牛干扰素γ，而N5的结合力稍弱但仍处于适用于诊断的范围内。重要的是，B7表现出非常低的“多反应性”，意味着它不太可能非特异性地黏附于血液中的其他成分，并且在检测刺激性牛血浆中的干扰素γ时，其表现几乎可与广泛采用的BOVIGAM结核检测试剂所用的商业抗体试剂相媲美。总体而言，这些结果表明，改良后的FLI-TRAP平台，结合初始的酵母富集步骤，能够仅用微生物培养、抗生素、磁珠和标准分子生物学工具可靠地产出高质量纳米抗体。对非专业读者来说，结论是作者改良了一个将活细胞变为抗体发现微型试验台的细菌筛选引擎，为像牛结核这样的疾病开发更廉价、本地生产的诊断试剂盒打开了通道，尤其是在成本和基础设施成为主要障碍的地区。

引用: Sirimanakul, S., Hurley, J.D., Thaiprayoon, A. et al. Modified protein selection strategy based on Escherichia coli’s Hitchhiker transport and validation through selection of nanobodies targeting bovine interferon gamma. Sci Rep 16, 13450 (2026). https://doi.org/10.1038/s41598-026-43280-7

关键词: 纳米抗体, 牛结核病, 牛干扰素γ, 大肠杆菌搭便车转运, 低成本诊断