一种可广泛推广的细胞内积累检测法，用于描绘哺乳动物细胞的细胞质药物递送情况

为何将药物送入细胞至关重要

当今许多最有前途的药物——小分子药物、称为肽的短蛋白片段以及完整蛋白——都是设计来作用于细胞内部的靶点。但细胞膜如同一道严密的安保闸门。药物可能停留在细胞表面或被困在称为内体的细胞囊泡中，却始终无法抵达许多靶点所在的水性内区——细胞质。本文介绍了一种新的实验室检测方法，称为 CHAMP 试验，它不仅告诉研究者分子是否进入细胞，还能判定分子是否真正到达能发挥作用的细胞质。

追踪药物进入的新方法

传统测量药物摄取的方法常将仅接触细胞表面、滞留在内体中或真正进入细胞质的分子混为一谈。它们还可能依赖体积较大的荧光标记，这会改变分子的行为。CHAMP 试验通过将一个小型化学“手柄”——叠氮基（azide）——与一个名为 HaloTag 的蛋白标记结合，解决了这两类问题。HaloTag 被工程化为在培养的人细胞细胞质中自由存在。首先，细胞用一种连接子处理，将 DBCO（一种应变炔）连接到 HaloTag 上。接着，研究人员加入带有微小叠氮标签的测试化合物。只有当该化合物穿过细胞膜进入细胞质时，叠氮基与 DBCO 才能通过高度选择性的化学“点击”反应结合在一起。最后用荧光叠氮染料显色以显示剩余的 DBCO 位点：细胞越暗表示测试化合物越多进入并占据了大部分位点；越亮则表示细胞质进入效果差。

从概念到可用的测定法

作者首先用标准的氯烷基染料成像，确认 HaloTag 在人体 HeLa 细胞中正确表达并定位于细胞质。随后他们优化了 CHAMP 的各个步骤：加入多少 DBCO 连接子、孵育多长时间，以及哪种荧光叠氮染料在不损伤细胞的情况下提供强而特异的信号。流式细胞术——一种可测量成千上万个单个细胞荧光的仪器——显示该试验快速、稳健且可调。关键是，研究团队证明荧光确实来源于 HaloTag 位点上的特异性反应，而非染料非特异性地附着在细胞组分上，并且微小的叠氮标签对分子进入细胞的方式没有明显干扰。

该试验对小分子和肽揭示了什么

有了 CHAMP，研究者用数百种叠氮标记的小分子对其进行了严格测试，并系统地改变了电荷、体积和柔性等特征。例如，他们观察到将带负电的羧酸转变为中性酰胺会增加在细胞质中的积累，氮甲基化的程度和位置也会改变化合物的进入能力。通过比较游离固相小珠上的反应与活细胞中的反应，研究者能够将内在的化学反应性与细胞膜本身施加的屏障区分开来。团队还将 CHAMP 应用于一组常见抗生素，显示出某些抗生素比其他的更容易到达细胞质——这在治疗藏匿于宿主细胞内的细菌时为重要信息。

超带电肽与蛋白质穿透屏障的表现

该试验对研究较大、带电量高且难以用其他方法追踪的分子尤其有用。作者考察了由多个精氨酸残基组成的穿透细胞肽，并证实了一个明显趋势：更长且带更多正电荷的链在一定范围内将更多物质输送到细胞质。他们还探究了将某些氨基酸的手性反转（镜像构型）如何改变进入能力，发现镜像版本有时积累得更好，暗示膜与分子之间存在微妙的手性相互作用。CHAMP 还显示，“超带电”蛋白——被设计为带有大量正电荷——比其常态对应物更能有效到达细胞质，支持它们作为大型治疗货物载体的潜力。

为未来细胞内药物制定的设计规则

通过对小分子、肽、大环肽和改性骨架的系统测试，该研究揭示了若干通用的设计原则。大环肽（其主链闭合成环）相比柔性的线性版本更容易到达细胞质。沿肽主链谨慎置入的 N-甲基基团能适度促进进入，但过多则可能适得其反。这些通过单一标准化试验揭示的结构—渗透关系，为化学家设计不仅能与靶点结合而且能真正进入细胞内部的分子提供了切实可行的指导。

这项技术如何助力药物开发

简单地说，CHAMP 试验是放在细胞门口及内部走廊的精细流量计。它告诉科学家哪些实验性药物真正穿过膜进入细胞质，而不会因表面或细胞内隔室中被困的分子而得到误导。由于该方法适用于各种分子形状和大小，并仅使用微小的叠氮标签，CHAMP 可被整合进高通量发现流程。随着时间推移，这应能加速针对那些最重要靶点被困在细胞内的疾病设计出更有效的治疗方案。

引用: Bhandari, S., Ongwae, G.M., Dash, R. et al. A generalizable assay for intracellular accumulation to profile cytosolic drug delivery in mammalian cells. Commun Chem 9, 94 (2026). https://doi.org/10.1038/s42004-026-01898-8

关键词: 细胞内药物递送, 细胞膜通透性, 细胞质积累, 穿透细胞肽, 生物正交点击化学