通过微同源介导的易位修复占优的定点策略优化小鼠胚胎中CRISPR的精确度

为什么制造更精确的基因编辑小鼠很重要

像CRISPR这样的基因编辑工具让构建模拟人类疾病的小鼠变得异常容易，但存在一个隐藏的问题：首代动物中的遗传改变往往杂乱且混合。这会使实验变慢、可靠性下降并且需要更多动物。本研究提出了一种方法，将小鼠胚胎中的CRISPR切割引导向高度可预测的结果，从而使大多数创始小鼠出生时携带相同且定义明确的突变——为基因编辑研究带来更清晰的生物学意义和更好的伦理性。

杂乱DNA修复的挑战

当CRISPR切割DNA时，细胞必须依赖自身的修复系统来修补断裂。最常见的通路称为非同源末端连接，它快速但不精确，会在切口处产生各种小的插入和缺失。另一条通路，微同源介导的末端连接（microhomology-mediated end joining），倾向于利用短的匹配序列作为引导，以刻板化的方式删除一段DNA片段。两者的效率都远高于精确但缓慢的同源定向修复。在常规CRISPR实验中，研究者主要关注导RNA的切割效率和脱靶位点的多少，而较少关注哪种修复通路会被偏好或会产生何种精确突变。其结果是许多创始小鼠在不同细胞中携带不同的突变拼凑，迫使研究者必须进行繁殖到下一代才能得到清洁、均一的基因型。

更聪明地挑选CRISPR导向序列

作者意在通过设计不仅关注强度和安全性，还关注可预测性的导向序列来改变这一局面。他们首先使用了inDelphi，这是一种基于大量细胞培养中CRISPR诱导突变数据训练的机器学习工具。inDelphi不仅指出某个位点被编辑的频率，还预测可能的插入和缺失的完整“菜单”以及每种突变出现的频率，特别关注由微同源驱动的事件。团队扫描了小鼠的酪氨酸酶（Tyr）基因——该基因功能丧失会使动物变白——并挑选出被预测为倾向产生强且可重复的微同源介导缺失同时保持低脱靶风险的导RNA。随后他们编辑小鼠胚胎并通过深度测序测量得到的突变。总体上，inDelphi为每个导向推荐的首选基因型在胚胎中的出现频率与预测相近，而具有更强微同源特征的导向确实产生了更统一的突变模式。

将干细胞用作彩排舞台

但仅有预测还不够。当团队将inDelphi的预测与实际编辑模式对比时，发现只有中等程度的一致性。为弥补这一差距，他们引入了一个实用的中间步骤：在与早期胚胎有许多共同特征的小鼠胚胎干细胞中测试每个导向。将这些细胞转染入CRISPR组分后，他们分选出被编辑的细胞并对目标位点进行测序。干细胞中的突变模式与胚胎中的匹配度远高于计算模型的预测。那些在干细胞中产生单一优势缺失的导向，通常在囊胚和更晚期胚胎中也表现相同。通过将inDelphi的排序与这种干细胞“彩排”相结合，研究人员能够可靠地挑选出驱动微同源介导修复并最小化突变等位基因多样性的导向。

从眼色到缺肢

作者将他们的流程在活体动物中进行了检验。对于Tyr基因，他们选择了三种分别代表高、中、低预测精确度的导向并将编辑后的胚胎移植到代孕母鼠体内。在发育第11.5天，他们检查了眼色素并对每个胚胎单独测序。高度偏向微同源的导向产生的胚胎大多呈白化，且携带一个优势的小缺失，常见于基因的两拷贝中且变化很小。较不优化的导向则产生了色素丧失与部分色素保留混合的表型，对应更复杂的一组突变。随后他们将相同方法应用于Fgf10基因，其功能丧失会导致胚胎无肢体。他们选择了一个被预测并在干细胞中证实会产生特定四碱基缺失且高度可能破坏基因的导向，最终在第15.5天得到的胚胎均为无肢，且富集了预期的缺失类型。在两个基因的实验中，相同的少数突变类型在inDelphi预测、干细胞、早期胚胎和后期胚胎中都占主导地位。

更干净的遗传学与更少的动物

在实践层面，这项研究为在小鼠中设计CRISPR实验提供了一个新模板。作者建议，不要急于直接从计算设计的导向进入胚胎编辑，而是采用一个集成流程：使用inDelphi和脱靶工具挑选可能偏向微同源介导缺失和移码突变的导向，在胚胎干细胞中测试这些导向以确认编辑效率和突变的一致性，然后仅将表现最佳的导向推进到胚胎工作。该策略产生的创始小鼠其细胞大多共享相同且表征明确的突变，使其能够立即用于模拟人类疾病——尤其是由反复出现的缺失型变化引起的疾病——同时减少了必须繁殖和筛查的动物数量。其结果是更清晰、更可重复的遗传学和一条更具伦理性的强大疾病模型之路。

引用: Lkhagvadorj, K., Okamura, E., Taki, T. et al. Optimizing CRISPR precision in mouse embryos via microhomology-mediated end joining-dominant targeting. Commun Biol 9, 371 (2026). https://doi.org/10.1038/s42003-026-09771-z

关键词: CRISPR, 小鼠模型, 基因组编辑, DNA修复, 疾病建模