针对性单细胞RNA测序技术的实用指南

为什么观察单个细胞很重要

你体内的每个细胞都携带相同的DNA，但不同细胞的行为大相径庭。它们通过开启或关闭特定基因并以微妙方式编辑RNA分子来实现这种差异。现代单细胞RNA测序可以同时读取数千个细胞中存在哪些RNA，但目前它仍错过了大部分信息。这篇综述解释了当下技术在哪些环节丢失信息，以及新的“靶向”方法如何被开发出来，以便在研究、诊断和治疗设计中聚焦RNA分子中最重要的部分。

当今方法的局限

标准的单细胞RNA测序有点像为每条信息拍一张快速快照，而不是拍摄完整电影。在大多数实验中，细胞中只有大约10–40% 的RNA被检测到，而且通常只读取它们的起始或末端。这意味着许多稀有但重要的RNA—例如定义细胞身份的标记，或携带致病突变的基因变体—很容易被遗漏。此外，从将组织解离成单细胞到将RNA逆转录成DNA并扩增的多个技术步骤都会引入系统性偏差。有些RNA在早期被截断，有些被过度代表，而另一些则在数据中完全消失。

为什么RNA的内部细节重要

RNA分子中最具医学相关性的信息往往位于其内部区域，而非标准方法能看到的末端。这些内部片段可能包含驱动癌症的点突变、两个基因异常连接处的融合点，或产生同一基因不同蛋白变体的剪接位点。它们还可能记录基因编辑工具（如CRISPR）的痕迹。作者将这些特定特征称为“感兴趣区域”，将携带它们的RNA称为“感兴趣转录本”。由于常见的大通量平台主要读取RNA的端点，它们经常忽视这些关键细节，尤其是在较长或低丰度的转录本中。

将聚光灯重新对准的新方法

为克服这些盲区，研究者们开发了一系列靶向单细胞RNA测序方法。这些方法不是试图平等地读取每条RNA，而是有意富集所选的转录本或区域。有些策略重新设计捕获微珠，使其能够结合内部RNA序列而不仅仅是尾端，从第一步就把选定信息拉入文库。还有的加入定制引物，从内部某点开始复制，或增加针对已建文库中部分基因的额外PCR步骤进行特异性扩增。另一类方法使用与目标RNA或其拷贝互补的DNA探针，然后用简单的化学标签进行拉下回收。每一类别在灵敏度、可处理细胞数量、可靶向基因数目和成本之间有所权衡，但目标一致：在相同或更少的测序读长下恢复更多有意义的细节。

从病毒到肿瘤的应用

这些靶向方法已经在若干生物学和医学领域带来变革。在感染研究中，它们能够捕获那些缺乏标准协议所需poly(A)尾的病毒或细菌RNA，从而揭示这些病原体所在的宿主细胞类型以及它们如何改变宿主基因活性。在癌症研究中，靶向单细胞测序可以精确定位携带特定突变或融合基因的细胞类型，并将这些变化与被改变的基因程序关联，帮助解释为何某些细胞对治疗产生耐药。其他方法侧重于可变剪接，发现哪些细胞类型使用哪些异构体，或集中于稀有细胞群体和细微标志，这些在常规测序中往往低于检测阈值。在混合的CRISPR筛选中，更好地捕获引导RNA使科学家能够将每个遗传扰动与其精确的细胞响应关联起来。

选择合适工具与未来方向

由于现在存在众多靶向方法，作者提出了一棵决策树来帮助研究者选择方法。关键问题包括是否需要全转录组分析、必须靶向多少基因或区域、这些区域距RNA端点有多远，以及可以处理多少细胞。展望未来，他们认为最大的进展将来自改善最初的捕获步骤、扩展巧妙的探针型策略以及将靶向方法与新兴的长读长和直接RNA测序平台结合。在能够从端到端读取每个细胞中每条RNA之前，靶向单细胞RNA测序仍将是揭示对生物学和疾病最重要细胞信息的必要工具。

引用: Moro, G., Brunner, E. & Basler, K. A practical guide to targeted single-cell RNA sequencing technologies. Commun Biol 9, 250 (2026). https://doi.org/10.1038/s42003-026-09675-y

关键词: 单细胞RNA测序, 靶向测序, 转录组学, 癌症突变, 空间转录组学