一种二合一蛋白标签实现单链抗体片段的可溶表达与钙依赖性纯化

让高效抗体更易制造

现代药物越来越依赖抗体片段——这些小而精准的“制导导弹”能够靶向癌细胞、炎症组织或致病分子。然而，这类有前景的药物在制造上并不容易：在细菌工厂中，它们往往发生聚集、错误折叠，并且抵抗常规纯化方法。本文介绍了一种新的蛋白附加片段，称为CSQ-tag，它同时解决了这两个问题，使这些片段能够以简单、低成本的方式更容易生产和净化。

为什么小型抗体很重要

全尺寸抗体已经改变了癌症、自身免疫疾病和眼科疾病的治疗，但它们的体积大、结构复杂也带来缺点：清除速度可能慢、未必能有效穿透肿瘤或组织，而且生产成本高。单链可变区片段（scFv）只保留抗体的识别端——识别靶标的那部分，并将其连接成一条链。这些紧凑分子更容易进入组织，并可被工程化成复杂的治疗剂和诊断工具。然而，在常见细菌如大肠杆菌中制造时，许多scFv会沉积成称为包涵体的不溶块，而且没有通用且简便的纯化方法。

一种二合一的辅助标签

研究者借鉴了肌肉细胞中天然储钙蛋白肌钙蛋白（calsequestrin），设计出他们称之为CSQ-tag的辅助标签。该标签异常酸性且高度柔性，具有长而无序的区域，像“熵刷”（entropic bristles）一样在附着蛋白周围扫开空间。当将其融合到四种通常聚集的治疗性scFv上时，CSQ-tag显著提高了在常规大肠杆菌细胞内保持溶解的量。相比之下，仅带简单His标签的同类scFv几乎完全不溶，带有CSQ-tag的版本平均可溶性约为84%，即便是在通常提供化学上更具挑战性折叠环境的细菌菌株中也表现良好。

胜过已有的标签技术

为了评估CSQ-tag与常用蛋白标签的比较，团队将其与SUMO、硫氧还蛋白（thioredoxin）、GST和MBP等广泛用于诱导难处理蛋白溶解的标签进行了对比。在针对抗VEGF scFv（眼科药物brolucizumab的基础）的直接比较中，只有MBP和CSQ显著改善了溶解性，而CSQ明显更胜一筹。在四种不同scFv中，CSQ使可溶产量比长期被认为是最佳选择之一的MBP平均提高大约1.8倍。进一步实验表明，肌钙蛋白中最酸性且最无序的第3结构域对该效应至关重要：去除它会显著降低溶解性，强调了标签的负电荷和结构松散性如何帮助防止伴侣蛋白相互粘连。

利用钙作为简单的纯化开关

除了帮助scFv溶解外，CSQ-tag还提供了内建的纯化技巧。肌钙蛋白在结合钙时天然会发生聚集，而在去除钙时又会解离。作者利用这一行为：向含有CSQ-tag scFv的细胞提取液中加入钙，促使带标签的融合蛋白聚集，而大多数细菌杂质仍保持溶解。一次快速离心即可沉淀下CSQ-tag融合蛋白；随后加入螯合钙的试剂EDTA又可将其高纯度（>95%）地重新溶解，无需昂贵的层析树脂。这种钙驱动的相变可重复进行且不会损伤蛋白，使其对大规模生产具有吸引力。

保持药物效力

对于任何治疗性分子来说，提高产量只有在最终产品仍保持活性时才有意义。将CSQ-tag用常规酶切除并进行最终抛光步骤后，团队测试了游离的抗VEGF scFv。其与靶标的结合强度与获批药物brolucizumab基本相同，详细的化学分析也证实了正确的内部二硫键以及缺乏有害聚集体。针对CD3受体的第二种特别难处理的scFv也显示出类似的活性保存。总体而言，CSQ-tag流程的产率比传统复性方法高出数倍，同时使用更简单的设备和更便宜的试剂。

对未来治疗的可能意义

通过将改良的溶解性与易于操作的纯化手柄合二为一，CSQ系统解决了抗体片段生产中长期存在的两个瓶颈。它使药物开发者能够使用生长快速且成本低廉的大肠杆菌菌株，同时仍能获得保持结合活性的高质量scFv。尽管仍需在去标签后的损失方面做一些优化，这种可由钙调控的标签有望简化不仅是抗体片段，也包括其他敏感治疗性蛋白的制造。对患者而言，这最终可能转化为更多种类的靶向生物药物以更高效、更低成本的方式生产出来。

引用: Lee, J., Park, H., Jeong, S. et al. Two-in-one protein tag enables the soluble expression and calcium-dependent purification of single-chain antibody fragments. Commun Biol 9, 326 (2026). https://doi.org/10.1038/s42003-026-09611-0

关键词: 单链抗体片段, 蛋白质表达, 肌钙蛋白标签, 钙依赖性纯化, 治疗性抗体