荧光尿苷 qU 在单链和双链 RNA 中亮度提高

为什么让 RNA 发光很重要

RNA 位于细胞功能的核心，也是许多新型药物设计的关键，从疫苗到前沿的基因疗法。要真正理解 RNA 在细胞内的行为——它去向何处、如何折叠、以及如何与其他分子相互作用——研究人员需要在不干扰其天然行为的前提下使其发光。本研究提出了一种新的发光构件，一种对天然 RNA 字母尿苷进行修饰的变体 qU，当被嵌入 RNA 链中时会异常明亮，这为更清晰、更精确地成像活体 RNA 提供了可能。

让 RNA 发光的新途径

用于追踪 RNA 的传统荧光染料通常附着在分子外部，且在化学上与 RNA 有较大差异。尽管亮度高，但它们可能改变 RNA 的行为，进而影响其折叠、配对或在细胞内的迁移。相比之下，“荧光碱基类似物”模拟 RNA 的天然碱基，直接插入碱基堆栈内部，提供了一种更为微妙的标记方式。作者关注一种新的类似物——四环尿苷（quadracyclic uridine，qU），此前在游离溶液中显示出有前景的亮度。在这里，他们提出问题：当 qU 真正被构建进 RNA 链时，它的荧光和对 RNA 结构的影响如何？

构建发光的 RNA 片段

为了解答这一问题，团队首先开发了一条多步化学路线，将 qU 转换为可用于常规自动化 RNA 合成的特殊形式（磷酰胺化物）。利用该方法，他们合成了短 RNA 片段，其中一个正常尿苷被 qU 替换，并系统地改变其相邻碱基。他们随后将这些携带 qU 的链与互补链配对形成双螺旋，或与稍有不匹配的链配对，并将结果与未修饰的 RNA 进行比较。整个过程中，他们使用了一系列光学技术——包括吸收与荧光测量、荧光寿命分析、RNA 熔解实验和圆二色谱——来评估 qU 的发光强度以及其对天然 RNA 架构的干扰程度。

嵌入真实 RNA 后更亮

其中一个最显著的发现是，qU 在置入 RNA 后反而变得更亮，无论是在单链还是双螺旋中。许多荧光碱基在被其他碱基包围后会发生猝灭；而 qU 则表现出相反的趋势。其荧光效率从在溶液中大约四分之一提升到嵌入 RNA 链时的约三分之二，使其成为迄今报道的最亮的尿苷类标记之一。具体亮度和激发态寿命取决于相邻碱基以及链是单链还是双链，这表明 qU 对其局部微环境十分敏感。这种敏感性可用于报告沿 RNA 的细微结构变化或碱基配对不匹配。

发光对 RNA 结构的影响

亮度的提升伴随着权衡。当 qU 取代 RNA 双螺旋中的天然尿苷时，螺旋的稳定性会降低：其熔解温度（衡量两链分离难易的指标）通常下降约 9 摄氏度。光谱特征表明 qU 主要采取一种（称为烯醇胺式）构象，该构象与尿苷通常配对的腺嘌呤不能完美配对。这种不完全配对可能增加局部“呼吸”或碱基翻转，轻微松弛修饰位点周围的螺旋。尽管存在这种不稳定化，圆二色谱测量显示 RNA 的整体螺旋形态仍为典型的 A 型，说明分子全局架构在局部稳定性降低的情况下仍被保留。

用 pH 与配对调节信号

作者还探讨了酸碱度和配对伙伴如何影响 qU 的发光。与游离分子一样，结合在 RNA 中的 qU 对 pH 变化非常敏感，尤其在偏碱或偏酸条件下，其亮度和荧光寿命下降且发色发生漂移。这使得 qU 成为探测局部 pH 变化的潜在探针，例如 RNA 在胞内被摄取进入酸性区室时的情况。有趣的是，当 qU 面对不匹配的配对而非其通常的腺嘌呤时，其亮度甚至可能比在正确配对的螺旋中更高，而且某些不匹配相对于具有相同不匹配的天然 RNA 来说，实际上还能稳定双链。这表明 qU 能在保持高发光性的同时，对正确与错误配对事件提供探测能力。

对未来 RNA 研究的意义

简而言之，这项工作提供了一个强大的新“电灯泡”，可以直接嵌入 RNA 的文本而不改写其整体形态。尽管以 qU 替换单个碱基会稍微削弱局部配对，但全局螺旋结构仍然完好，其卓越的亮度以及对环境的强响应使 qU 成为要求严格实验（包括荧光显微镜和细胞内寿命成像）的有吸引力的内部标记物。将 qU 策略性地置于 RNA 的柔性或未配对区域，可能使研究人员能够跟踪治疗性 RNA、观察结构重排并研究结合事件，获得高晰度信息，同时尽可能保持 RNA 的天然状态。

引用: Karlsson, A.F.E., Pfeiffer, P., Le, HN. et al. Increased brightness of fluorescent uridine, qU, inside single- and double-stranded RNA. Sci Rep 16, 8481 (2026). https://doi.org/10.1038/s41598-026-43188-2

关键词: 荧光 RNA 标记, 尿苷类似物, 核酸成像, RNA 结构, 荧光碱基类似物