将 ABE9 融合到 SpRY Cas9 切口酶可实现无旁观基因的精确小鼠模型构建

为更好的疾病模型打造更精准的工具

许多严重疾病源于我们 DNA 中的单个字母错误。为了解并最终治疗这些病症，科学家常常造出携带与患者相同突变的小鼠。但要如此精确地改写 DNA 比想象中困难：旧方法可能在基因组上留下疤痕、引入额外突变，并混淆实验结果。本研究推出了一种精炼的基因编辑工具，称为 ABE9-SpRY，旨在只改变特定的单个 DNA 字母，同时尽可能不动邻近字母和基因组其他部分。

从粗暴切割到温和修饰

传统 CRISPR-Cas9 编辑像分子剪刀，会切断 DNA 的两条链。细胞对这些断裂的修复并不完美，常留下小的插入或缺失，从而不可预测地破坏基因。这在使基因失活时有用，但不足以模拟精确的致病突变。相比之下，碱基编辑器不切开 DNA，而是化学性地将一个 DNA 字母改为另一个——在这里是将 A 变为 G——同时保持双螺旋完整。这种方法大幅减少了大片段缺失和重排，但早期的腺嘌呤碱基编辑器仍存在三大问题：有时会编辑邻近的“旁观”碱基；只能作用于旁边带有特定短序列标签的位置；并且偶尔在基因组其他位置产生非预期的编辑。

设计出更具选择性的分子铅笔

研究者着手同时解决这三项限制。他们以 ABE9 为起点，这是一种新型碱基编辑器变体，其作用集中在非常窄的 DNA 区段内，将“编辑窗口”缩小，使得被误改的邻近碱基大幅减少。随后他们将 ABE9 与一种工程化的 Cas9 切口酶 SpRY 融合。与需要严格“NGG”标签的标准 Cas9 不同，SpRY 可以识别更广泛的 DNA 序列，从而能够到达先前无法触及的与疾病相关位点。由此得到的融合工具 ABE9-SpRY 旨在既高精确又在靶位选择上更灵活。

在细胞与胚胎中检验新编辑器

为检验 ABE9-SpRY 是否达到设计目标，团队将其与一种广泛使用但更“激进”的编辑器 ABE8e-SpRY 进行了比较。他们针对四个位于编码离子通道（TPC1、TPC2 和 TRPM4）的疾病相关位点，这些通道在心脏和肝脏功能中具有重要作用。在体外培养的小鼠神经细胞中，ABE8e-SpRY 虽然在目标碱基上的编辑效率更高，但也修改了许多邻近碱基。相比之下，ABE9-SpRY 虽然产生的总体编辑较少，但“干净”结果的比例更高——即测序读长中只有预期的字母被改变，当地区域没有额外突变。小鼠胚胎中的结果也呈现相同模式。当研究者将编辑组分注入受精卵时，ABE8e-SpRY 常常将靶基因近乎全部拷贝都转换，但伴随许多旁观改变。ABE9-SpRY 虽然总体编辑拷贝较少，但在其发挥作用的位点，DNA 序列通常按计划被精确校正。

更干净的编辑、更少的副作用

精确性不仅关乎局部 DNA 邻域。团队还评估了编辑器是否影响基因组远端区域。他们结合计算预测和靶向测序，测量了小鼠胚胎中可能的相似位点的离靶改变。ABE8e-SpRY 经常在这些位置引入非预期的 A 到 G 的改变，有时水平出人意料地高。ABE9-SpRY 则显示出远少的此类事件，仅有罕见的离靶编辑，并且在一种专门检测 Cas9 非依赖性 DNA 损伤的试验中未检测到活性。重要的是，当单独使用 ABE9-SpRY（而非混合测试）在小鼠中引入两个特定突变时，它产生了许多创始动物，其中所需编辑以高比例存在并可靠遗传给后代，同时旁观改变或小型插入/缺失极少。

将精确编辑扩展到人类干细胞

鉴于患者特异性干细胞在研究疾病和测试药物方面日益普遍，研究者也在人体诱导多能干细胞中测试了 ABE9-SpRY。他们针对人类 TPC1 基因中与小鼠位点等效的位置。借助荧光报告子富集已编辑细胞，他们发现 ABE8e-SpRY 虽然产生更高的原始编辑率，但同样修改了多个邻近碱基。ABE9-SpRY 编辑的等位基因总体较少，但完美编辑片段（仅有一次预期改变且无其它改变）的比例明显更高，伴随较少破坏性的插入或缺失。在需要扩增单个克隆以供详细研究的干细胞工作中，这类“干净”编辑通常比蛮力式的高效率更有价值。

这对未来疾病研究的重要性

对于试图理解单个 DNA 字母改变如何导致疾病的科学家来说，额外的非预期突变会严重误导研究结论。本研究表明，ABE9-SpRY 尽管在原始编辑速度上略逊一筹，但能以惊人的精确性和广泛的靶向灵活性将单字母变化写入小鼠和人类干细胞基因组。这使其成为构建忠实的人类遗传病动物与细胞模型的有前景的工具，尤其适用于那些哪怕一个多余突变也可能混淆生物学结果或阻碍潜在疗法的发展情形。

引用: Ong, J.K., Bhunia, S., Hilbert, B. et al. ABE9 fused to SpRY Cas9 nickase enables precise generation of bystander free mouse models. Sci Rep 16, 7463 (2026). https://doi.org/10.1038/s41598-026-40642-z

关键词: 腺嘌呤碱基编辑, CRISPR 疾病模型, 小鼠遗传学, 离靶效应, 诱导多能干细胞基因编辑