FLEXTAG：一种小巧且可自我更新的蛋白标记系统，用于抗褪色的多色超分辨成像

在细胞内部看见不可见之物

现代生物学在很大程度上依赖于拍摄维持细胞生命的分子。然而，即便是最好的光学显微镜也面临一个简单却棘手的问题：用于标记蛋白的发光标签会迅速褪色，而且在不干扰细胞功能的前提下同时标记多种靶点也很困难。这篇论文介绍了FLEXTAG，一类新型小巧且可更新的标签，它们能显著延长发光时间、支持多色成像，并能与科学家用来观察细胞内部结构的最强显微镜配合使用。

为何要拍出更清晰的细胞照片这么难

传统荧光显微镜可以分辨大约四分之一微米的结构，但这仍远大于多数单个蛋白的尺寸。超分辨方法能挤出更多细节，达到纳米尺度，但前提是荧光标记须表现良好。如今流行的蛋白标签要么体积庞大的抗体、要么较暗的荧光蛋白、或是其染料在这些技术所需的强光下很快失活的化学标签。为详细成像而用化学试剂固定细胞也可能把蛋白交联在一起，阻碍染料到达靶位点，而游离的染料分子可能非特异性吸附，造成背景荧光，模糊图像。

一种可重复填充的全新蛋白标签

作者设计FLEXTAG（全称为用于可交换、抗X损伤标记的荧光标记，适用于先进通用纳米显微法）以直接应对这些限制。FLEXTAG并非单一标签，而是由三种协调工作的成员组成——FLEXTAG1、FLEXTAG2和FLEXTAG3——每个都是小型工程蛋白（12–18千道尔顿，约为经典标签如GFP的一半，且远小于HaloTag）。每种FLEXTAG可结合与之匹配的小分子配体，该配体携带明亮的有机染料。关键在于这种结合是可逆的：染料–配体分子不断进出。当一个荧光团被光损伤时，来自周围溶液的新分子会替代它，因此信号实际上实现了“自我更新”，而不是持续衰减。

构建三种紧凑且可靠的标签

为创造FLEXTAG1–3，团队改造了来自细胞生物学和药物设计的三种知名蛋白支架，并用结构建模和基于成像的测定来调整它们的行为。FLEXTAG1源自识别经修饰小分子的溴结构域；作者通过引入突变打破其聚对形成倾向，同时保留对配体的强结合。FLEXTAG2来自细菌二氢叶酸还原酶，通过添加策略性二硫键并调整柔性连接肽，他们稳定了蛋白并显著提高了在任何时刻带染料的标签比例，同时保持结合可逆。FLEXTAG3基于用于化学生物学的人源FKBP蛋白；在此，团队在结合强度和速率之间取得平衡，使染料能够足够快地解离以被替换，但仍足够牢固以提供明亮图像并避免过度聚集。

在固定过程保护标签并降低背景光

鉴于许多重要实验需要对固定细胞成像，研究者开发了一种“保护性固定”策略。在加入醛类固定剂之前，他们先用未标记版本的各配体充盈活细胞，堵塞标签的结合位点。在固定过程中，这些保护性配体保护易受损的氨基酸免受化学交联。固定后，洗去保护性配体并用荧光配体替换，恢复对标签的可访问性。额外步骤——化学还原以中和残余的活性基团，以及含白蛋白、去垢剂和变性盐的封闭混合物——进一步减少游离染料的黏性非特异性结合。综合这些措施，可在保留活细胞中约60–70%标记的同时，大幅提升信噪比。

在多种成像方法中实现更清晰、更持久的影像

在确立FLEXTAG框架后，作者在主要超分辨显微镜家族中对其进行了全面测试。在结构化照明和STED等图案化照明方法中，FLEXTAG允许线粒体、微管、内质网和肌动蛋白的多色成像，褪色远少于常规共价标签；经过数十个成像周期，传统标签的信号下降一半或更多，而FLEXTAG信号几乎保持恒定。在单分子方法如PAINT和STORM中，FLEXTAG配体的快速开–关交换产生了丰富且稳定的定位流，可被重建为三维、多色的亚细胞结构图，即便在活细胞中也能持续数分钟。FLEXTAG2在PAINT中显示出特别有利的动力学特性，而FLEXTAG3在长时间的STORM影片中表现出色。由于这些标签彼此正交且兼容多种染料，研究人员可以同时标记多种蛋白，然后根据研究问题选择最合适的成像模式，而无需更改底层构建体。

这对观察细胞内部意味着什么

FLEXTAG提供了一种通用且可补充的连接器，将蛋白与明亮染料连接起来。其小巧体积降低了标签改变蛋白定位或功能的风险，其自我更新的染料有助于规避在高功率显微镜中长期存在的光漂白问题。通过将这些标签与保护性固定和背景抑制化学方法配对，研究者可以获得更清洁、更持久且更丰富多彩的蛋白组织和运动图像。在实际意义上，这意味着更好的细胞结构图谱、更可靠的分子相互作用时序追踪，以及一个应当惠及基础细胞生物学与依赖于纳米尺度病变可视化的转化研究的多功能工具箱。

引用: Zhang, H., Yao, Y., Wang, X. et al. FLEXTAG: a small and self-renewable protein labeling system for anti-fading multi-color super-resolution imaging. Nat Commun 17, 2156 (2026). https://doi.org/10.1038/s41467-026-69658-9

关键词: 超分辨率显微镜, 荧光蛋白标记, 活细胞成像, 抗光漂白性能, 细胞结构