单细胞结构生物学与细胞内电子晶体学

一次观察一个细胞中的生命形态

蛋白质是维持每个细胞生命活动的微小机器，但要真正理解它们如何运作，科学家需要以高分辨率看到它们的三维形态。传统上，这意味着需要大量纯化蛋白并在细胞外培育大型而脆弱的晶体——这一过程常常缓慢且易失败。本研究提出了一种新方法，利用电子而非X射线，直接从单个细胞内的单个晶体读取蛋白结构。这为在普通实验室乃至单细胞水平上实现高分辨率结构生物学指明了方向。

藏在活细胞内的晶体

一些蛋白质天然会在活细胞内聚集成微小晶体，承担诸如储存、防护或帮助细胞应对胁迫等功能。研究人员也可以通过工程手段让细胞大量产生特定蛋白，从而诱导此类晶体形成。这种“细胞内”结晶有两个重要优势：蛋白质从未离开其类似天然的环境，诸如糖基化修饰或小分子结合等脆弱特性得以保留，而这些往往在常规试管结晶中失去。然而，一个主要障碍仍然存在：许多实验中，只有极少数细胞实际形成晶体，因此传统的X射线方法需要成千上万的晶体，从而需要大量细胞。

一种新途径：用电子替代X射线

作者提出了一种称为IncelluloED的方法，将细胞内结晶与三维电子衍射结合。电子与物质的相互作用远强于X射线，这意味着可以从更小、更少的晶体中获得有用数据。团队选择了一种真菌蛋白HEX‑1作为示范，该蛋白通常形成六角形晶体，有助于在胁迫下堵塞真菌细胞间的微小孔隙。通过在昆虫细胞内表达该蛋白，他们制备出了规则的显微晶体，作为新流程的测试对象。

把单个晶体变成详尽的结构图

要读取细胞内HEX‑1的结构，研究人员必须定位并小心地将样品中合适的区域薄化。首先，他们将含晶体的细胞在微小金属网格上冷冻并在表面覆盖一层薄铂。借助低温光学显微镜，他们扫描网格的大面积以定位含晶体的细胞，并测量晶体在表面下的三维位置。随后将相同样品转入一台将扫描电子显微镜与聚焦离子束结合的专用仪器。借助先前的光学图像进行指引，他们去除周围材料，刻出穿过选定晶体的超薄切片（层片），厚度仅数百纳米——非常适合电子穿透。

电子从微小体积中揭示原子细节

制备好的层片随后被转移到一台在低温下运行的高端电子显微镜。随着晶体切片在显微镜中缓慢旋转，受控的电子束穿过样品，形成一系列衍射图样——这些精细的斑点排列编码着原子的位置信息。研究团队从约1.6立方微米的晶体体积中重建出HEX‑1的完整三维结构，分辨率达到1.9埃，足以建立蛋白大部分侧链的模型。即使是更小约0.8立方微米的体积，也能获得几乎相同的结构，仅分辨率略低。重要的是，与需要超过6万晶体且总体晶体体积大约大700万倍的传统串行X射线方法得到的模型高度一致。

这对结构生物学意味着什么

并列比较显示，从单个细胞内电子衍射晶体确定的结构与用X射线从数万晶体平均出的结构本质上相同。任何差异都很小，主要出现在柔性环区，这些区域本来就存在天然运动。研究人员还证明所用的电子剂量足够低，避免了严重的辐射损伤，而且他们处理的每个晶体都产生了高质量的数据。尽管制备超薄层片仍需技巧与时间，但实现这一流程所需的仪器——低温光学显微镜、聚焦离子束系统和低温电子显微镜——现在已在许多研究中心普遍配备。

从大量细胞迈向单细胞结构实验室

这项工作表明，如今可以仅凭单个细胞内的一个晶体在不纯化蛋白的情况下确定原子级别的蛋白结构。IncelluloED在只有少数细胞形成晶体或蛋白质难以在不丢失重要伴侣或化学基团的情况下分离时，尤其有用。随着工作流程的进一步自动化并扩展到更多蛋白，这项方法可能使研究人员探索结构在细胞间的变异、在其天然环境中研究与疾病相关的变化，甚至直接在活细胞中辅助药物发现。事实上，该研究将“单细胞结构实验室”的设想推得更近了一步。

引用: Bílá, Š., Pinkas, D., Khakurel, K. et al. Single-cell structural biology with intracellular electron crystallography. Nat Commun 17, 2109 (2026). https://doi.org/10.1038/s41467-026-69205-6

关键词: 电子衍射, 细胞内晶体学, 单细胞结构生物学, 蛋白质结构, 低温电镜