用于活细胞内无标记成像的干涉成像扫描显微镜，可实现120纳米横向分辨率

在不添加染料的情况下观察活细胞

现代生物学常常依赖发光荧光标签来揭示细胞内部的隐秘结构。但这些标签可能会给细胞施加压力、改变其行为，有时在脆弱或难以改造的样本中根本无法使用。本文介绍了一种新的方法，可以在不添加任何染料或基因标签的情况下，以高细节观察活细胞中的生命过程——这有望实现对细胞更温和、持续且更自然的观察。

通过光的散射来观察细胞

该方法建立在一类不依赖荧光的技术基础上，而是测量微小结构如何散射光。其中一种方法——干涉散射显微镜（iSCAT）——将纳米尺度物体散射的光与来自玻璃表面的参考反射光混合。由此产生的干涉图样对蛋白质、病毒或囊泡等极小粒子极为敏感。iSCAT 以前在简单、干净的样本（例如玻片上的孤立粒子）上效果最好。然而，要将其应用到活细胞深处一直很困难，因为细胞内部拥挤而杂乱：许多重叠的散射事件产生了斑点状背景，掩盖了精细结构。

将两种思路结合以获得更清晰、更温和的成像

为克服这些限制，作者将 iSCAT 与一种强大的成像策略——图像扫描显微镜（ISM）相结合。在 ISM 中，样品用聚焦光束逐点扫描，不是使用单一探测器，而是由探测器像素阵列记录每个点的多个略微位移的视图。通过巧妙地重新对齐并组合这些视图，可以在不丢弃宝贵光子数量的情况下锐化最终图像。新技术——干涉图像扫描显微镜（iISM）——将该思想适配到更复杂、对相位敏感的干涉散射信号中。该显微镜使用蓝色激光、特殊光学元件以实现对称光偏振，并配备灵敏相机记录每个扫描位置的散射和反射光。然后，定制的计算工作流程以尊重波动性质的方式重新分配像素信息，从而得到约120纳米横向分辨率的图像，分辨率约为常规衍射极限光学的两倍。

智能算法将噪声图样变为清晰图像

由于干涉信号同时携带亮度和相位信息，荧光成像中常用的处理技巧并不足以处理它们。作者设计了一种适用于相干光的自适应像素重分配（APR）流程。首先，他们将每个细小的干涉图样转换为“径向方差”图，这种图突出对称中心而不在意信号是正还是负。此步骤有效地将复杂的干涉条纹转换为更像传统强度图的图像。接着，使用开源软件确定每个探测像素图像相对于中心的位移，并在累加前将它们相应地移回。经过精细对齐后，有用信号被集中，而噪声被平均化，与紧针孔共焦 iSCAT 图像相比，在相同光强下对比-噪声比约提升了四倍。

观察细胞器与细胞骨架的动态

借助这些技术进步，团队在活的 COS-7 细胞上测试了 iISM 的实际表现。在极低的照明功率下——每个聚焦点约为常规共焦显微镜典型使用量的十分之一左右——他们能够清晰辨识关键细胞器：内质网、线粒体、囊泡、肌动蛋白细胞骨架、质膜，以及称为层缘伪足的薄弱前沿结构。由于干涉对比对垂直位置非常敏感，相似的细胞器可能呈现正或负对比，从而揭示仅几百纳米的微小高度差异。通过记录时间序列，他们追踪了囊泡的运动和内质网管的重塑，持续数分钟而未见明显光损伤，也没有迹象表明成像本身干扰了细胞行为。

将无标记视图与荧光图谱相匹配

为验证无标记图像确实反映了真实的细胞结构，研究者还在固定细胞中进行了 iISM 与荧光 ISM 的联合测量。他们用红色荧光染料染色肌动蛋白细胞骨架，并记录了超分辨率荧光图像与同一区域的无标记 iISM 图像。当两者叠加时，荧光通道中明亮的肌动蛋白细丝与 iISM 图像中的纤状特征高度对应。在某些区域，iISM 甚至揭示了额外的散射细节——例如沿细丝的变化或邻近未标记结构（如粘着斑）——这些在荧光通道中不可见。总体而言，这些结果表明 iISM 能既验证已知结构，又发现未标记环境中的额外信息。

以更小干扰开启观察细胞的新窗口

对非专业读者而言，关键结论是 iISM 提供了一种在不使细胞产生人工发光的情况下观察其内部精细结构的方法。它将干涉散射的灵敏度与图像扫描的锐化能力结合，在使用远低于许多现有显微镜的光强下实现约120纳米的分辨率。由于其由高级共焦系统中常见的组件构成，原则上可以添加到商业仪器中。未来，iISM 可与传统荧光、快速探测器或甚至机器学习“虚拟染色”配合使用，以在更接近自然、未受扰动的条件下跟踪感染、货物运输或细胞骨架重排过程。

引用: Küppers, M., Moerner, W.E. Interferometric Image Scanning Microscopy for label-free imaging at 120 nm lateral resolution inside live cells. Light Sci Appl 15, 129 (2026). https://doi.org/10.1038/s41377-026-02210-y

关键词: 无标记成像, 活细胞显微镜, 干涉散射, 超分辨率, 细胞细胞器