Микроскопия отдельных молекул без флуоресценции с помощью электронного резонансного стимулированного рамановского рассеяния

Новый способ наблюдать отдельные молекулы

Возможность наблюдать работу отдельных молекул изменила биологию и медицину — от отслеживания перемещений белков внутри клеток до чтения последовательностей ДНК. Сегодня это в основном делается с помощью светящихся флуоресцентных меток, но при большом разнообразии меток их сигналы накладываются друг на друга. В этом исследовании предложен новый тип контраста в микроскопии, который совсем не зависит от свечения. Вместо этого он «слушает» крошечные колебания специально разработанных молекул, открывая путь к более четкой, детальной и гибкой визуализации жизни на уровне отдельных молекул.

Почему светящиеся красители достигают предела

Флуоресцентные красители были основным инструментом современной микроскопии. Они яркие, их можно прикреплять к конкретным молекулам и они достаточно чувствительны, чтобы выявлять отдельные белки или молекулы ДНК. Однако каждый флуорофор испускает свет в относительно широком диапазоне длин волн. Когда нужно одновременно визуализировать многие разные мишени, эти широкие спектры перекрываются, и различить один молекулярный тип от другого становится трудно. Чтобы обойти это, исследователи часто проводят многочисленные циклы окрашивания и промывки, что долго и может повредить деликатные образцы.

Слушая молекулярные вибрации вместо света

У каждой молекулы есть уникальная схема колебаний — что-то вроде отпечатка пальца в том, как ее атомы колышутся и растягиваются. Эти колебания можно исследовать методами, такими как рамановская и инфракрасная спектроскопия, которые фиксируют крошечные сдвиги цвета света при взаимодействии с колеблющейся связью. Вибрационные «отпечатки» чрезвычайно узкие по сравнению с флуоресцентными спектрами, поэтому теоретически десятки разных молекул могут быть различены одновременно. Загвоздка в том, что вибрационные сигналы естественно слабы, поэтому предыдущие методы либо требовали металлических наноструктур для усиления сигнала, либо по‑прежнему опирались на флуоресценцию для считывания, возвращая те же проблемы с фоном.

Усиление рамановского сигнала без флуоресценции

Авторы опираются на метод, называемый электронно-резонансным стимулированным рамановским рассеянием (ER‑SRS), который резко усиливает вибрационные сигналы путем подбора цвета одного лазерного луча к электронному переходу в молекуле, а разницы цветов двух лучей — к конкретному вибрационному режиму. Ранние версии ER‑SRS испытывали трудности, потому что те же условия, которые усиливали рамановский сигнал, также создавали большой нежелательный электронный и флуоресцентный фон. Чтобы решить эту проблему, команда подошла к ней с двух сторон: они разработали лазерную систему с двумя независимо настраиваемыми лучами и создали новую семью молекулярных зондов, которые сильно поглощают в ближнем инфракрасном диапазоне, но практически не флуоресцируют. Эти «раманово-усиленные нефлуоресцентные молекулы-зонды» (RANMPs) имеют конъюгированное ядро с четырьмя нитрильными группами, богатыми вибрациями, которые дают сильные и узкие рамановские отпечатки.

Проектирование тихих, но отзывчивых молекулярных зондов

Ключевой химический прием заключается в том, что молекулы RANMP быстро отводят энергию в нефлуоресцентное триплетное состояние вместо того, чтобы излучать ее в виде флуоресценции. Тяжелые атомы, такие как сера, в структуре повышают скорость этого отвода, эффективно гасив свечения, при этом позволяя вибрационному режиму возбуждаться лазерными лучами. Квантово‑химические расчеты направляли дизайн так, чтобы цвет поглощения и нитрильная вибрация попадали в диапазон настройки лазера. Тщательная корректировка структуры молекул позволила смещать точную вибрационную частоту и силу сигнала, создав несколько родственных зондов с различными, но близко расположенными рамановскими отпечатками. При оптимизированных условиях ER‑SRS эти молекулы давали вибрационные сигналы в сотни раз сильнее, чем стандартный флуоресцентный краситель, использованный в более ранних работах, и при этом с гораздо меньшим фоновым уровнем.

Наблюдение отдельных частиц и отдельных молекул

Имея эти компоненты, команда продемонстрировала возможности нового подхода. Сначала они упаковали красители RANMP в крошечные полимерные наночастицы, известные как polymer dots, которые дополнительно концентрируют зонды и подавляют остаточную флуоресценцию. С помощью ER‑SRS они визуализировали отдельные точки в растворе и различили два типа зондов, чьи нитрильные вибрации отличались лишь незначительно, фактически достигнув двухцветного одиночного‑частичного изображения за один проход. Затем зонды были разбавлены до уровня нескольких молекул, внедренных в тонкую пластиковую пленку. При защите образца от повреждений и регулировке мощности и синхронизации лазеров они зарегистрировали четкие, ограниченные дифракцией точки, которые гасли пошагово — признак детектирования одиночных молекул. Они также показали, что эти точки исчезают, когда смещают временную синхронизацию или разность частот между двумя лучами так, что они выходят за пределы нитрильной вибрации, и вновь появляются при восстановлении условий, подтверждая, что сигнал действительно возникает от конкретной колебательной связи.

Что это значит для будущей визуализации

Проще говоря, исследование доказывает, что можно увидеть и различить отдельные молекулы, используя только их вибрационные отпечатки, без опоры на свечение. Поскольку вибрационные линии узкие и могут быть настроены с помощью химического дизайна, это даёт мощный путь маркировать множество различных мишеней одновременно с минимальным наложением. Нефлуоресцентная природа зондов также снижает фоновый сигнал и должна упростить наблюдение глубже в тканях, где рассеянная флуоресценция обычно подавляет сигнал. Хотя необходима дальнейшая работа по адаптации этих зондов для живых клеток и расширению палитры «цветов», ER‑SRS с RANMPs указывает на будущее, в котором карты отдельных молекул сложных биологических образцов можно будет составлять с беспрецедентной чёткостью и возможностями множественной маркировки.

Цитирование: Oh, S., Eom, Y., Kim, H.Y. et al. Fluorescence-free single-molecule microscopy via electronic resonance stimulated Raman scattering. Nat Commun 17, 2720 (2026). https://doi.org/10.1038/s41467-026-69348-6

Ключевые слова: микроскопия отдельных молекул, стимулированное рамановское рассеяние, вибрационная визуализация, нефлуоресцентные зонд, множественная биовизуализация