Интерферометрическая микроскопия сканирования изображения для безметочной визуализации с разрешением 120 нм в поперечнике внутри живых клеток

Наблюдение живых клеток без вводимых красителей

Современная биология часто опирается на светящиеся флуоресцентные метки, чтобы выявить скрытую архитектуру внутри клеток. Но эти метки могут вызывать стресс у клеток, менять их поведение и иногда вовсе непригодны для хрупких или трудно модифицируемых образцов. В этой работе предложен новый способ наблюдать процессы внутри живых клеток с высоким уровнем детализации — без применения красителей или генетических меток — что обещает более щадящие, длительные и естественные наблюдения за реальной работой клеток.

Рассматривая клетки по тому, как они рассеивают свет

Метод опирается на семейство подходов, не зависящих от флуоресценции, а измеряющих, как мельчайшие структуры рассеивают свет. Один из таких методов, интерферометрическая микроскопия рассеяния (iSCAT), смешивает свет, рассеиваемый нанообъектом, с эталонным отражением от стекла. Получающаяся интерференционная картина чрезвычайно чувствительна к очень маленьким частицам, таким как белки, вирусы или везикулы. Ранее iSCAT давал наилучшие результаты на простых, чистых образцах — например, изолированных частицах на стекле. Однако применение его глубоко внутри живых клеток было затруднено: клетки густонаселены и «грязны», и множественные перекрывающиеся события рассеяния создают зернистый фон, который скрывает тонкие детали.

Сочетание двух идей для резче и бережнее визуализации

Чтобы преодолеть эти ограничения, авторы объединили iSCAT с мощной стратегией визуализации — микроскопией сканирования изображения (ISM). В ISM образец сканируется точка за точкой сфокусированным пучком, и вместо одного детектора массив пикселей фиксирует множество слегка смещённых видов каждой точки. При хитром выравнивании и объединении этих видов можно улучшить резкость итогового изображения, не теряя драгоценных фотонов. Новая техника — интерферометрическая микроскопия сканирования изображения, или iISM — адаптирует эту идею к более сложным, чувствительным к фазе сигналам интерферометрического рассеяния. Микроскоп использует синий лазер, специальные оптики для симметризации поляризации света и чувствительную камеру для записи рассеиваемого и отражённого света на каждой позиции сканирования. Затем специально разработанный вычислительный поток перераспределяет информацию по пикселям с учётом волновой природы сигнала, давая изображения с поперечным разрешением около 120 нанометров, примерно вдвое лучше, чем у стандартной дифракционно-ограниченной оптики.

Умные алгоритмы превращают шумные узоры в чёткие картины

Поскольку интерферометрические сигналы несут и амплитудную, и фазовую информацию, привычные приёмы обработки из флуоресцентной микроскопии недостаточны. Авторы разработали адаптивную процедуру перераспределения пикселей (APR), специально настроенную для когерентного света. Сначала они преобразуют каждую небольшую интерферометрическую картину в «радиальную карту дисперсии», которая подчёркивает центры симметрии независимо от того, положителен ли сигнал или отрицателен. Этот шаг эффективно превращает сложные интерференционные фринг-узоры в изображения, которые ведут себя более как обычные интенсивностные картины. Затем, с помощью открытого программного обеспечения, они определяют, насколько изображение каждого пикселя детектора сдвинуто относительно центра, и смещают их обратно перед суммированием. Такое уточнённое выравнивание концентрирует полезный сигнал и усредняет шум, повышая отношение контраст/шум примерно в четыре раза по сравнению с конфокальным iSCAT с плотным пинхолом при том же уровне освещения.

Наблюдение за органеллами и цитоскелетом в работе

После этих технических достижений команда испытала iISM на живых клетках COS-7, чтобы оценить его практическую эффективность. При очень низкой мощности освещения — примерно в десять раз меньше на каждую фокусную точку, чем обычно используют в конфокальных микроскопах — они чётко различали ключевые органеллы: эндоплазматический ретикулум, митохондрии, везикулы, актиновый цитоскелет, плазматическую мембрану и тонкие структуры на переднем крае, называемые ламеллиподиями. Поскольку интерферометрический контраст чувствителен к вертикальной позиции, похожие органеллы могли проявляться с положительным или отрицательным контрастом, раскрывая тонкие различия по высоте всего в несколько сотен нанометров. Записывая таймлапсы, исследователи отслеживали перемещение везикул и перестройку трубочек эндоплазматического ретикулума в течение многих минут, не наблюдая заметного фотоповреждения и не видя признаков того, что само изображение нарушало поведение клеток.

Сопоставление безметочных изображений с флуоресцентными картами

Чтобы убедиться, что безметочные изображения действительно отражают реальные клеточные структуры, исследователи провели комбинированные измерения iISM и флуоресцентной ISM в фиксированных клетках. Они окрасили актиновый цитоскелет красным флуоресцентным красителем и записали сверхразрешающие флуоресцентные изображения рядом с безметочными iISM-изображениями той же области. При наложении два канала показали хорошее совпадение: яркие актиновые филаменты во флуоресцентном канале соответствовали филаментозным структурам в iISM. В некоторых областях iISM даже обнаруживал дополнительные детали рассеяния — например, вариации вдоль филаментов или соседние немеченные структуры, такие как фокальные адгезии — которые были невидимы во флуоресцентном канале. В совокупности эти результаты показывают, что iISM может подтверждать известные структуры и при этом раскрывать дополнительную информацию о немеченом окружении.

Новое окно в клетки с меньшим воздействием

Для неспециалистов ключевая мысль в том, что iISM предлагает способ видеть тонкие детали внутри живых клеток без искусственного свечения. Он сочетает чувствительность интерферометрического рассеяния с возможностью повышения резкости, присущей микроскопии сканирования изображения, достигая порядка 120-нанометрового разрешения при значительно меньшей освещённости, чем во многих существующих микроскопах. Поскольку система построена из компонентов, уже распространённых в современных конфокальных установках, её, по сути, можно добавить к коммерческим инструментам. В будущем iISM может работать в паре с традиционной флуоресценцией, быстрыми детекторами или даже методами машинного обучения для «виртуальной» окраски, чтобы отслеживать инфекции, транспорт грузов или перестройки цитоскелета в условиях, более близких к естественному, ненарушенному состоянию клеток.

Цитирование: Küppers, M., Moerner, W.E. Interferometric Image Scanning Microscopy for label-free imaging at 120 nm lateral resolution inside live cells. Light Sci Appl 15, 129 (2026). https://doi.org/10.1038/s41377-026-02210-y

Ключевые слова: безметочная визуализация, микроскопия живых клеток, интерферометрическое рассеяние, сверхразрешение, клеточные органеллы