Skalowana produkcja w trybie fed-batch rekombinowanego alfa-1-antytrypsyny przez komórki CHO w jednorazowym, powierzchniowo napowietrzanym bioreaktorze orbitalnie wstrząsanym

Dlaczego to białko ma znaczenie dla pacjentów

Alfa-1-antytrypsyna (A1AT) to białko ochronne, które pomaga osłaniać płuca i inne narządy przed uszkodzeniami wywołanymi przez enzymy zapalne. Osoby z wrodzonym niedoborem A1AT mogą rozwijać wczesne, ciężkie choroby płuc i inne komplikacje. Obecne leczenie polega głównie na regularnych infuzjach A1AT oczyszczonej z ludzkiej osocza — terapiach dożywotnich, kosztownych i uzależnionych od ograniczonych zapasów plazmy. W niniejszym badaniu badacze sprawdzają, jak wytwarzać A1AT w kontrolowanym, przemysłowym systemie hodowli komórek, co mogłoby w przyszłości zapewnić bardziej niezawodne i skalowalne źródło tego ważnego leku.

Od dawców krwi do fabryk opartych na komórkach

Obecna terapia A1AT opiera się na białkach pozyskiwanych z osocza ludzkich dawców. Poza wysokimi kosztami, podejście to jest narażone na niedobory dostaw i wiąże się z pozostałym ryzykiem przenoszenia wirusów. Równocześnie naukowcy odkrywają kolejne potencjalne zastosowania A1AT, w tym łagodzenie szkodliwych stanów zapalnych, ochronę przeszczepianych narządów oraz pomoc w schorzeniach takich jak cukrzyca, artretyzm, zawał serca, udar czy ostre niewydolności wątroby. To wszystko zwiększa popyt. Aby zerwać zależność od dawców, badacze dążą do wytwarzania rekombinowanej ludzkiej A1AT (rhA1AT) — tej samej ludzkiej cząsteczki, lecz produkowanej przez zmodyfikowane komórki hodowane w bioreaktorach.

Dlaczego komórki CHO i plastikowe wstrząsane zbiorniki

Zespół wybrał komórki chomika chińskiego (CHO), które są podstawą współczesnej produkcji biofarmaceutyków. Komórki CHO dobrze rosną w dużych hodowlach zawiesinowych bez surowicy, dodają białkom wzorce glikozylacji przypominające ludzkie i wydzielają produkt bezpośrednio do pożywki, co upraszcza oczyszczanie. Zamiast tradycyjnych stalowych zbiorników z mieszadłem, badacze zastosowali jednorazowy, orbitalnie wstrząsany bioreaktor (SB10-X). System ten to w praktyce duże, sterylne plastikowe naczynie poruszane ruchem okrężnym, podczas gdy gaz przepływa nad powierzchnią cieczy. W porównaniu z mechanicznymi zbiornikami mieszającymi, systemy wstrząsane są prostsze w instalacji, tańsze w eksploatacji na małą skalę i bardziej delikatne dla komórek wrażliwych na ścinanie, a jednocześnie przypominają warunki mieszania i napowietrzania stosowane w standardowych kolbach wstrząsanych używanych w wczesnych eksperymentach.

Wybór najlepszej linii komórkowej

Rozpoczynając od uprzednio zmodyfikowanych komórek CHO produkujących rhA1AT, badacze izolowali dziesięć pojedynczych klonów i obserwowali je przez trzy miesiące. Dla każdego klonu mierzyli tempo wzrostu komórek i ilość A1AT produkowaną na komórkę w czasie, zarówno z użyciem, jak i bez powszechnie stosowanego leku selekcyjnego (metotreksat). Choć niektóre klony produkowały więcej białka, miały zwykle wolniejszy wzrost. Jeden klon — nazwany Klon 2 — stanowił dobre kompromisowe rozwiązanie: rósł stosunkowo szybko i utrzymywał stabilną, przyzwoitą wydajność produkcji A1AT przez 12 tygodni. Na podstawie tych skonsolidowanych cech Klon 2 wybrano do skalowania i dalszego opracowania procesu.

Skalowanie i dostrajanie środowiska komórek

Wykorzystując Klon 2, zespół najpierw prowadził hodowle typu fed-batch w standardowych kolbach wstrząsanych, gdzie komórkom dostarcza się z czasem dodatkowe składniki odżywcze, by zwiększyć plony. Następnie przenieśli ten sam proces do jednorazowego, 10-litrowego bioreaktora SB10-X. W obu systemach komórki osiągnęły wysoką gęstość, lecz bioreaktor uzyskał do około 20% wyższe szczytowe poziomy A1AT niż kolby, dzięki lepszej kontroli tlenu i pH. Wydajność przypadająca na jedną komórkę — ile białka każda komórka produkuje dziennie — była podobna w obu systemach (około 10–12 pikogramów na komórkę na dzień), co potwierdza, że proces można skalować bez utraty wydajności. Naukowcy śledzili również uważnie składniki odżywcze, takie jak glukoza i glutamina, oraz produkty uboczne, jak mleczan i amoniak. Obniżając początkowy poziom glutaminy w drugim przebiegu bioreaktora, zmniejszyli nagromadzenie amoniaku mniej więcej o połowę, nie szkodząc produktywności, chociaż doprowadziło to do większego stężenia mleczanu, co podkreśla konieczność starannego wyważenia składników odżywczych i produktów ubocznych.

Wytworzenie bezpiecznego, funkcjonalnego produktu końcowego

Po zebraniu materiału rhA1AT zostało klarowane i oczyszczone w dwóch etapach chromatograficznych, dając pojedynczy, czysty pik białkowy w HPLC i około 70% odzysku ogólnego. Co ważne, aktywność biologiczna białka — jego zdolność do hamowania elastazy, szkodliwego enzymu płucnego — wzrosła z około jednej trzeciej aktywnej w materiale wyjściowym do około dwóch trzecich po pierwszym etapie oczyszczania i utrzymała się na wysokim poziomie dalej. Zespół badał też tolerancję rhA1AT na warunki kwaśne, które często stosuje się do inaktywacji wirusów przy produkcji przeciwciał. Stwierdzono, że białko jest stabilne w pobliżu pH neutralnego, ale traci odzyskiwalną ilość przy niższych wartościach pH, co sugeruje, że standardowa niska kwasowość stosowana do inaktywacji wirusów mogłaby uszkodzić produkt i że potrzebne są alternatywne strategie usuwania lub unieszkodliwiania wirusów.

Co to oznacza dla przyszłych terapii

Mówiąc prosto, praca ta pokazuje, że technicznie możliwe jest hodowanie zmodyfikowanych komórek CHO w jednorazowych, delikatnie wstrząsanych bioreaktorach w celu wytwarzania medycznie istotnych ilości aktywnej alfa-1-antytrypsyny. Chociaż dalsza optymalizacja — taka jak lepsze strategie dokarmiania, zmiany temperatury lub pH oraz kontrola metabolitów — mogłaby jeszcze zwiększyć plony, badanie ustanawia skalowalną, elastyczną platformę, która mogłaby zmniejszyć zależność od A1AT pochodzącej z osocza. Jeśli procesy te zostaną pomyślnie przetłumaczone i rozbudowane, mogą przyczynić się do bardziej stałych, bezpieczniejszych i potencjalnie tańszych dostaw A1AT dla osób z niedoborem genetycznym oraz do nowych zastosowań terapeutycznych obecnie badanych.

Cytowanie: Tang, W.Q., Jiang, C.Q.Z., Zheng, Z.Y. et al. Scaled up fed-batch production of recombinant alpha-1-antitrypsin by CHO cells in single-use surface aerated orbital shaken bioreactor. Sci Rep 16, 7790 (2026). https://doi.org/10.1038/s41598-026-37353-w

Słowa kluczowe: alfa-1-antytrypsyna, komórki CHO, bioreaktor, białko rekombinowane, produkcja biologicznych leków