Produzione in fed-batch su scala aumentata di alfa‑1‑antitripsina ricombinante da cellule CHO in bioreattore orbitale agitato monouso a aerazione superficiale

Perché questa proteina è importante per i pazienti

L’alfa‑1‑antitripsina (A1AT) è una proteina protettiva che aiuta a difendere i polmoni e altri organi dai danni causati da enzimi infiammatori. Le persone nate con carenza di A1AT possono sviluppare precocemente malattie polmonari gravi e altre complicazioni. Oggi il trattamento principale consiste in infusioni regolari di A1AT purificata da donazioni di sangue umano — una terapia a vita, costosa e dipendente da una fornitura di plasma limitata. Questo studio esplora come produrre A1AT in un sistema di coltura cellulare controllato e industrializzato, che un giorno potrebbe fornire una fonte più affidabile e scalabile di questo importante farmaco.

Dalle donazioni di sangue alle fabbriche cellulari

La terapia attuale si basa su proteine estratte dal plasma umano donato. Oltre al costo elevato, questo approccio è vulnerabile a carenze di approvvigionamento e comporta un rischio residuo di trasmissione virale. Contemporaneamente, gli scienziati continuano a scoprire nuovi potenziali usi per l’A1AT, tra cui la modulazione di processi infiammatori dannosi, la protezione di organi trapiantati e l’impiego in condizioni come diabete, artrite, infarto, ictus e insufficienza epatica acuta. Tutto ciò aumenta la domanda. Per svincolarsi dalla dipendenza dai donatori umani, i ricercatori puntano a produrre alfa‑1‑antitripsina umana ricombinante (rhA1AT) — la stessa proteina umana, ma generata da cellule ingegnerizzate coltivate in bioreattori.

Perché cellule CHO e serbatoi di plastica agitati

Il gruppo ha scelto le cellule di ovaio di criceto cinese (CHO), il cavallo di battaglia della produzione biofarmaceutica moderna. Le CHO crescono bene in colture di sospensione su larga scala senza siero, aggiungono pattern di glicazione simili a quelli umani alle proteine e secernono il prodotto direttamente nel mezzo di coltura, semplificando la purificazione. Invece dei tradizionali serbatoi agitati in acciaio inossidabile, i ricercatori hanno usato un bioreattore orbitale agitato monouso (SB10‑X). Questo sistema è essenzialmente un grande contenitore di plastica sterilizzato mosso con moto circolare mentre il gas scorre sulla superficie del liquido. Rispetto ai serbatoi meccanicamente agitati, questi sistemi agitati sono più semplici da installare, più economici da gestire a piccola scala e più delicati con cellule sensibili al taglio, pur riproducendo condizioni di miscelazione e aerazione simili a quelle degli shake flask usati negli esperimenti iniziali.

Selezionare la linea cellulare vincente

Partendo da cellule CHO già ingegnerizzate per produrre rhA1AT, i ricercatori hanno isolato dieci singole «cloni da cellula singola» e le hanno monitorate per tre mesi. Per ciascun clone hanno misurato la velocità di crescita e la quantità di A1AT prodotta per cellula nel tempo, sia con che senza un comune farmaco di selezione (metotrexato). Alcuni cloni producevano più proteina ma tendevano a crescere più lentamente. Un clone — denominato Clone 2 — ha offerto un buon compromesso: cresceva relativamente rapidamente e manteneva una produzione stabile e rispettabile di A1AT per 12 settimane. Sulla base di questi tratti combinati, il Clone 2 è stato scelto per la scala superiore e per lo sviluppo del processo.

Scala superiore e messa a punto dell’ambiente cellulare

Utilizzando il Clone 2, il team ha prima condotto colture in fed‑batch in shake flask standard, dove alle cellule vengono forniti nutrienti aggiuntivi nel tempo per aumentare le rese. Hanno poi trasferito lo stesso processo a un bioreattore monouso agitato SB10‑X da 10 litri. In entrambi i casi le cellule hanno raggiunto elevata densità, ma il bioreattore ha ottenuto fino a circa il 20% in più di A1AT al picco rispetto ai flask, grazie a un migliore controllo di ossigeno e pH. La produttività specifica per cellula — quanto prodotto ogni cellula al giorno — è stata simile tra i sistemi (circa 10–12 picogrammi per cellula al giorno), confermando che il processo è scalabile senza perdita di prestazioni. Gli scienziati hanno inoltre monitorato da vicino nutrienti come glucosio e glutammina e prodotti di scarto come lattato e ammonio. Riducendo il livello iniziale di glutammina nella seconda corsa del bioreattore, hanno dimezzato approssimativamente l’accumulo di ammonio senza danneggiare la produttività, sebbene questo abbia portato a un aumento del lattato, sottolineando la necessità di bilanciare con attenzione nutrienti e sottoprodotti.

Ottenere un prodotto finale sicuro e funzionale

Una volta raccolto, l’rhA1AT è stato chiarificato e purificato attraverso due passaggi cromatografici, ottenendo un singolo picco proteico netto all’HPLC e circa il 70% di recupero complessivo. Importante, l’attività biologica della proteina — la sua capacità di inibire l’elastasi, l’enzima polmonare dannoso — è aumentata da circa un terzo attivo nel materiale di partenza a circa due terzi attivo dopo il primo step di purificazione, mantenendosi elevata successivamente. Il team ha anche testato la tolleranza dell’rhA1AT a condizioni acide spesso usate per inattivare i virus nella produzione di anticorpi. Hanno trovato che la proteina è stabile vicino al pH neutro ma perde materiale recuperabile a pH più basso, suggerendo che la comune inattivazione virale a basso pH danneggerebbe il prodotto e che sono necessarie strategie alternative di rimozione o inattivazione virale.

Cosa significa per le terapie future

In termini concreti, questo lavoro dimostra che è tecnicamente fattibile coltivare cellule CHO ingegnerizzate in bioreattori monouso agitati delicatamente per produrre quantità clinicamente rilevanti di alfa‑1‑antitripsina attiva. Pur essendo possibili ulteriori ottimizzazioni — come strategie di alimentazione migliorate, cambi di temperatura o pH e controllo dei metaboliti — che potrebbero aumentare ulteriormente le rese, lo studio stabilisce una piattaforma scalabile e flessibile che potrebbe ridurre la dipendenza dall’A1AT derivata dal plasma. Se tradotti ed estesi con successo, tali processi potrebbero contribuire a garantire una fornitura più stabile, sicura e potenzialmente più economica di A1AT per le persone con deficit genetico e per i nuovi usi terapeutici attualmente in fase di esplorazione.

Citazione: Tang, W.Q., Jiang, C.Q.Z., Zheng, Z.Y. et al. Scaled up fed-batch production of recombinant alpha-1-antitrypsin by CHO cells in single-use surface aerated orbital shaken bioreactor. Sci Rep 16, 7790 (2026). https://doi.org/10.1038/s41598-026-37353-w

Parole chiave: alfa‑1‑antitripsina, cellule CHO, bioreattore, proteina ricombinante, produzione di biologici